Нейтрофильные внеклеточного ловушки, порожденных низкой плотности нейтрофилов получены перитонеальный лаваж жидкости посредником рост опухолевых клеток и вложения

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о роли субпопуляций нейтрофилов в иммунологии опухолей, особенно о механическом участии внеклеточных ловушек нейтрофилов, или НЭО, в метастазировании опухоли. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет визуализировать адгезивные взаимодействия опухолевых клеток с интактными НВЛ. Применение этого метода распространяется и на терапию рака.

Поскольку НВЛ, полученные из определенных субпопуляций нейтрофилов, могут способствовать метастазированию опухоли. Демонстрировать процедуру будет Дзюнко Сёниохара из нашей лаборатории. Чтобы получить нейтрофилы, сначала введите один литр обычного стерильного физиологического раствора непосредственно перед закрытием раны непосредственно в брюшную полость пациента, который только что перенес абдоминальную операцию из-за злокачественности желудочно-кишечного тракта, и обильно промывайте брюшную полость в течение не менее одной минуты.

Затем перемешайте физиологический раствор в полости и восстановите 200 миллилитров промытой жидкости с помощью четырех 50-миллилитровых шприцев. В лабораторных условиях жидкость для промывания брюшины через нейлоновый фильтр толщиной 100 микрометров помещается в отдельные пробирки объемом 50 миллилитров для центрифугирования. Повторно суспендируйте гранулы в 5 миллилитрах PBS с добавлением 0,02% ЭДТА и тщательно наложите на каждую клетку суспензию на три миллилитра градиентного раствора плотности.

После разделения градиента плотности соберите два-три миллилитра промежуточного слоя из каждой пробирки и промойте образцы перитонеальной жидкости в 10 миллилитрах свежего PBS плюс EDTA на пробирку. Сгруппируйте гранулы в 10 миллилитрах свежего PBS плюс EDTA для дополнительной промывки и разбавьте клетки до 10 до 7 клеток на 60 микролитров буферной концентрации при магнитно-активированной сортировке клеток, или MACS. Заблокируйте любое неспецифическое связывание с помощью 20 микролитров Fc-блока на 10 минут при четырех градусах Цельсия с последующим добавлением 20 микролитров анти-CD66b магнитных шариков.

Через 10 минут при четырех градусах Цельсия промойте и повторно суспендируйте элементы в 500 микролитрах буфера MACS и добавьте элементы в магнитный столб соответствующего размера в магнитном поле подходящего магнитного сепаратора. Когда все CD66b-отрицательные ячейки пройдут через колонку, добавьте 15 миллилитров свежего буфера MACS в резервуар колонки и перенесите колонку из магнитного сепаратора в новую коническую трубку. Затем немедленно погрузите колонку, чтобы промыть магнитно маркированный CD66b положительный результат в трубку.

После центрифугирования повторно суспендируют выделенные нейтрофилы низкой плотности в соотношении 5 умно-10 на 10 до 6 клеток на миллили RPMI1640 тр среды с добавлением концентрации FBS и затравки 1 миллилитра нейтрофилов на лунку с шестилуночным покрытием из поли-L-лизина. Через два часа при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислом газе окрашивайте клетки в каждой лунке подходящим флуоресцентным мембранным непроницаемым ядерным и хромосомным красителем в соответствии с инструкциями производителя и немедленно наблюдайте за морфологией НВЛ с помощью флуоресцентной микроскопии. Для оценки адгезии опухолевых клеток к НВЛ повторно суспензировали опухолевые клетки желудка, окрашенные контрастным флуоресцентным красителем в соотношении 10 к шестой на миллилитр RPMI1640 с добавлением 0,1% бычьего сывороточного альбумина и добавили по одному миллилитру опухолевых клеток в каждую лунку культур нейтрофилов низкой плотности.

Через пять минут при 37 градусах Цельсия удалите надосадочную жидкость из каждой лунки и аккуратно промойте клетки два раза 2 миллилитрами предварительно подогретой RPMI1640 среды с добавлением БСА на промывку. Пятиминутной инкубации достаточно для обнаружения специфического связывания NET. Добавьте подогретую среду к боковой стороне каждой лунки, медленно покрутите пластину и удалите надосадочную жидкость с помощью аспиратора.

Затем НВЛ и прикрепленные опухолевые клетки можно наблюдать с помощью флуоресцентной микроскопии. Для покадровой видеосъемки культуры захваченных опухолевых клеток и окрашивания перитонеальных нейтрофилов низкой плотности в 35-миллиметровой чашке, покрытой поли-L-лизином, как показано на рисунке, с последующей кратковременной промывкой в двух миллилитрах 0,1% БСА плюс RPMI1640. Замените среду на одну умноженную на 10-шестую неокрашенные клетки опухоли желудка, взвешенную в двух миллилитрах РПМИ с добавлением БСА в течение пятиминутной инкубации при комнатной температуре.

В конце инкубации промойте клетки в двух миллилитрах свежего RPMI с добавлением BSA в течение пяти минут при комнатной температуре с последующим легким взмахом для удаления любых неприкрепленных опухолевых клеток. Затем замените надосадочную жидкость на DMEM, дополненную FBS и антибиотиками, и установите чашку в полновидовую систему наблюдения за клетками для покадрового анализа захвата опухолевых клеток НВЛ. После двух часов культивирования CD66b положительные нейтрофилы низкой плотности, полученные из жидкости перитонеального лаважа, демонстрируют струнные структуры при зеленом флуоресцентном ядерном и хромосомном окрашивании, в то время как CD66b отрицательные мононуклеарные клетки этого не делают.

Однако, когда культуры нейтрофилов низкой плотности предварительно обрабатываются 100 единицами на миллилитр ДНКазы I, характерные структуры разрушаются, что указывает на то, что структуры состоят из внеклеточной ДНК, выброшенной из нейтрофилов. Когда нейтрофилы низкой плотности культивируются на пластиковых пластинах без покрытия, можно наблюдать множество кластеров НВЛ, плавающих в среде, с небольшим количеством НВЛ, прикрепленных к дну чашки. После пятиминутной инкубации с флуоресцентно меченой линией опухолевых клеток желудка многие опухолевые клетки прикрепляются к нейтрофилам внутри НВЛ, что не наблюдается после предварительной обработки ДНКазой I. Аналогичные паттерны адгезии наблюдаются и для других опухолевых клеток.

ОКУМ-1 и ПНГК-4. Интересно, что в то время как НВЛ постепенно исчезают в течение нескольких часов после продолжительного совместного культивирования опухолевых клеток, опухолевые клетки, захваченные НВЛ, начинают активно размножаться после высвобождения НВЛ. Во время этой процедуры важно помнить, что из-за слабого прилегания НЭО к тарелке процессы мытья и переноса посуды должны выполняться с особой осторожностью.

После своего развития этот метод открывает путь для исследователей в различных областях биомедицинской науки для изучения причинно-следственной связи НЭО с различными заболеваниями, такими как тромбоз, синдром системной воспалительной реакции и аутоиммунные заболевания.