Micropuncture боуменова пространства в мышей, облегчается 2 фотона микроскопия
11 октября 2018 г.
Мы представляем использование 2-Фотон микроскопии поставить микропипеткой боуменова мочевыводящих пространстве в мышей, сочетая 2 основополагающими методами почечной физиологии. Использование 2-Фотон микроскопии преодолевает критические ограничения обычных микроскопии для исследования почек физиологии micropuncture.
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы по однонефроновой физиологии, включая гломерулярную скорость фильтрации системных белков и метаболитов и их вклад в трубчатую физиологию. Основным преимуществом этой техники микропунктюра является то, что он позволяет получить доступ к космосу Боумана и корковому нефрону у всех мышей. Как правило, люди, новые для этого метода будет бороться, поскольку она требует правильно выполненных шагов подготовки.
После подтверждения отсутствия ответа на щепотку ноша, нанесите мазь на глаза и использовать ленту для обездвиживания конечностей от 20 до 25 граммов взрослой мыши. Используйте крем для удаления всех волос на левой стороне животного, и использовать селезенку, чтобы найти левую почку через кожу на спинной и хвостовой стороне селезенки. Сделайте 0,5-сантиметровый разрез в коже, а затем меньший разрез в брюшной полости достаточно большой для почки, чтобы быть проталкивается.
Выдавить почку с нежным давлением и поместить полисилоксановый стабилизатор почек форму вокруг ткани. Выровните почку вверх с spacer так что более десхальная поверхность почки удлиняет за стабилизатором около одним миллиметром, и фиксирует почку к форме с клеем cyanoacrylate. Клей головную пластину к форме стабилизатора и смонтировать головную пластину для монтажа баров на базовой пластине.
Затем заполните колодец в поддержке полисилоксана раствором агарозы и удерживайте 10-миллиметровую крышку на верхней части формы до тех пор, пока агароза не будет твердой. Печать крышки скольжения к голове пластины с клеем и создать кольцо вокруг крышки скольжения с зубным цементом. Затем ввините от 100 до 150 микролитров ретро-орбитальной FITC-Dextran и быстро переместит мышь и пластину фиксации на двухкотонную стадию микроскопа.
После ручного фокусировки на поверхности почек, переключитесь на несканируемый двухфотографий режим и исследуйте окно изображения, чтобы найти целевой гломерул, который больше, чем 30 микрометров ниже крышки скольжения и менее 400 микрометров от боковой капсулы почки. Завехать боковое и вертикальное расстояние до цели glomerulus. Затем зайдите координаты сцены x, y и z для glomerulus.
И, наконец, поднять объективный координационный центр примерно на один миллиметр в колонку воды, не изменяя координаты x и y stage. Заготовите наконечник пипетки в колонку воды и включите возбуждение DAPI. Перемести пипетку в размеры x и y до точки максимальной флуоресценции кончика.
Это будет центром цели. Измените настройку цитирования x на красный флуоресцентный белок и визуализируете пипетку с глазным, чтобы обеспечить точное центрирование глазного вида. Переключитесь на двух-фотон, чтобы найти пипетку под живым двух-фотоном зрения и разместить наконечник именно в центре изображения, это положение регистрации.
Затем сохраните изображение пипетки и зарегистрируйте координаты сцены и контроллера микропипеда. Удалите пипетки из колонки воды в х-оси, не перемещая y и z-оси и переместить пипетки z к цели glomerulus z-координаты и края почки. Обратите внимание на этап x и вычислите пипетку края почки x с помощью смещения от стадии регистрации x.
Увеличьте стадию x, чтобы переместить сцену к пипетке, пока край почки не будет далеко слева от экрана, оставаясь видимым. Быстро заранее пипетки около 100 микрометров от почки края пипетки X только что вычислил. Увеличьте красный усиления и начать продвижение пипетки кончик медленно к краю почки под живой двух-фотонной визуализации при мониторинге красный пиксель гистограммы.
Привод пипетки в x-оси медленно glomerulus целевой пипетки х, следя за сценой х. По достижении glomerulus, документ позиции с z-стек. С пипеткой в положении, установить микропамп для введения 100 нанолитров перфторекалина в течение двух минут.
Для обеспечения проходимости пипетки, а также уменьшить путаницу от пипетки подключения во время входа. После четырех-шести минут фильтрации установите микропамп для аспирации до 300 нанолитров со скоростью до 50 нанолитров в минуту. Этот красивый, вблизи поверхности glomerulus демонстрирует благоприятную визуализацию из-за поверхностного положения glomerulus на 20 микрометров ниже почечной капсулы.
Glomerulus слишком близко к поверхности для микроинъекции однако, как пипетка ударит крышку скольжения. Эти гломерули оптимально расположены с боковой краями 250 микрометров вправо и появляются менее острыми из-за преломления, вызванного их 70 микрометровой глубиной от капсулы. Оба фактора, которые делают glomeruli доступным.
В этом типичном изображении ввода почек, средняя проекция интенсивности от z-стек с ортогональными видами показывает наконечник пипетки в пространстве Боумана, обратите внимание на красную пипетку наконечник спектральный артефакт от чрезвычайно яркой флуоресценции квантовых точек расположены на конической части кончика. Здесь, объем рендеринга от z-стек приобрел после позиционирования пипетки в пространстве Боумана, показывает пипетку наконечник в пространстве, примыкающих капиллярный пучок. Если используется пипетка со слишком большим отверстием, почечная капсула может сломаться, вызывая субкапсулярное кровотечение и вход крови в люмен пипетки.
Используя этот метод, 17 белков, в первую очередь низкого молекулярного веса, были определены как минимум из двух уникальных пептидов на белок. В сочетании с этим методом, другие методы, такие как маспектроскопия, ионные чувствительные измерения электродов, и флуоресцентные инъекции антител могут быть использованы для ответа на вопросы о роли светящихся растворов в трубной и гломерулярной физиологии.
Обзор
В данном исследовании изучается физиология отдельного нефрона с использованием уникального метода двухфотонной микроскопии для доступа к полости Боумена у мышей. Результаты демонстрируют потенциал данного подхода для измерения скорости клубочковой фильтрации белков и метаболитов, что позволяет получить новые данные о физиологии канальцев.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Физиология одиночного нефрона
- Физиология почек
- Гломерулярная фильтрация
Теоретическая справка
- Понимание функции почек на уровне отдельного нефрона имеет критическое значение для физиологических исследований.
- Традиционная микроскопия имеет ограничения при использовании методов микропунктуры.
- Двухфотонная микроскопия обеспечивает расширенные возможности визуализации.
Используемые методы
- Метод микропункции с использованием двухфотонной микроскопии
- Модельная система на мышах
- Флуоресцентная визуализация с применением FITC-декстрана и DAPI
Основные результаты
- Данный метод позволяет измерять скорость клубочковой фильтрации в режиме реального времени.
- Устранены такие распространенные проблемы, как закупорка пипетки при введении.
- В отобранной избыточной жидкости было идентифицировано 17 белков.
Выводы
- Данный метод расширяет возможности изучения физиологии почек у живых животных.
- Он открывает новые пути для дальнейших исследований роли растворенных веществ в функции почек.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный метод обеспечивает прямой доступ к полости Боумена у мышей, преодолевая ограничения традиционной микропункции и двухфотонной визуализации, что позволяет проводить вмешательства и измерения на уровне отдельного нефрона. Он способствует валидации мишеней и снижению рисков при изучении механизмов в исследованиях физиологии почек, обеспечивая количественный анализ аспирата из гломерулярного фильтрата. Метод повышает прогностическую достоверность доклинических моделей, позволяя в режиме реального времени измерять давление, заряд, поток и молекулярный состав внутри нефрона.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное открытие и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет анализировать скорость клубочковой фильтрации системных белков и метаболитов для валидации терапевтических мишеней.
- Практическая ценность: обеспечивает доступ к полости Боумена и корковому нефрону у всех мышей, что способствует проведению воспроизводимых исследований по взаимодействию с мишенями.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Облегчает подготовку валидированных биологических систем для последующего анализа, обеспечивая возможность извлечения фильтрата из пространства Боумена и сегментов нефрона.
- Практическая ценность: Способствует стандартизации анализа за счет количественного определения аспирированных белков и метаболитов методом жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: способствует развитию исследований систем, имеющих значение для патологии, позволяя измерять роль просветных растворенных веществ в физиологии канальцев и клубочков.
- Практическая ценность: обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации, обеспечивая возможность многократного доступа к физиологии отдельного нефрона у живых животных.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в континуум исследований — от валидации мишени до доклинических испытаний, — обеспечивая прямой доступ к нефронам для изучения механизмов действия и получения показателей, согласованных с биомаркерами.
- Основополагающая биология: способствует проверке гипотез и уточнению путей передачи сигналов, обеспечивая возможность микропункции пространства Боумена для оценки процессов фильтрации и реабсорбции.
- Скрининг: повышает готовность и воспроизводимость анализов за счет стереотаксического наведения и визуализации пипеток с покрытием из квантовых точек для точного таргетирования клубочков.
- Аналитика: обеспечивает количественные измерения давления, заряда, потока и молекулярного состава (например, 17 низкомолекулярных белков с помощью LC/MS) для сравнения экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями, позволяя проводить лонгитюдные исследования транспорта растворенных веществ в моделях заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: создает универсальную платформу для исследования физиологии почек в рамках множества проектов благодаря ее адаптивности к различным методам считывания данных (ион-селективные электроды, флуоресцентные антитела, масс-спектрометрия).
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования за счет уменьшения механистической неоднозначности физиологии отдельного нефрона посредством прямого анализа аспирата.
- Практическая ценность: Улучшает стандартизацию и масштабируемость благодаря стереотаксической стабилизации почки и навигации пипеты под визуальным контролем.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки («go/no-go»), предоставляя ранние данные на уровне нефрона о фильтрации белков и метаболитов, что снижает биологические риски на поздних этапах.
- Влияние на портфель проектов: Позволяет осуществлять приоритизацию почечных мишеней с учетом рисков на основе количественных данных о потоке и составе жидкости из пространства Боумена.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области ренальной хирургии, двухфотонной микроскопии и работы с микропипетками.
- Зависит от наличия двухфотонного микроскопа, микропипеток с покрытием из квантовых точек, стереотаксического аппарата и систем стабилизации из агарозы.
- Необходимо межгрупповое согласование стандартов хирургической подготовки, параметров визуализации и протоколов сбора аспирата.
- Требуется адаптация методов для различных линий мышей и моделей заболеваний, влияющих на глубину залегания и доступность клубочков.
- Ограничено глубиной визуализации (~100 μm под капсулой) и риском сосудистой травмы при введении пипетки, что может привести к субкапсулярному кровоизлиянию при недостаточно осторожном выполнении.
