Инженерные трансплантации подходит сетчатки пигментного эпителия ткани, полученных из человеческих эмбриональных стволовых клеток

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о самотерапии глаза, например, какова эффективность специально разработанной биоинженерной ткани in vivo. С помощью этой техники мы предлагаем метод получения и контурирования ткани сетчатки, а также стратегию обработки ткани для имплантации глаза в животную модель. Начните с промывки от одного до четырех кусочков амниотической оболочки человека размером 30 на 30 мм.

Закрепите нейлоновые скаффолды два раза в 80 мл PBS за одну стирку в бутылке объемом 250 мл на шейкере на высокой скорости в течение пяти минут. После второй промывки добавьте 40 мл рабочего раствора термолизина в каждую бутылку и встряхните бутылки два раза в течение пяти минут при 450 оборотах в минуту, после чего последует 30 секунд вортексинга. После второго раунда лечения термолизином промойте кусочки еще два раза 80 мл PBS на одну стирку, как показано на рисунке.

Затем с помощью длинных стерильных щипцов перенесите hAM по отдельности в 10-сантиметровую чашку для культивирования, содержащую 10 мл PBS. Затем поместите одну мембрану нейлоновой стороной вниз во вторую 10-сантиметровую чашку для культивирования PBS и отсоедините два из четырех зажимов, удерживающих мембрану на нейлоне. Вставьте меньшее кольцо культурального вкладыша между нейлоном и мембраной, убедившись, что мембрана полностью покрывает меньшее кольцо.

Прикрепите вторую часть вставки для культуры к верхней части мембраны так, чтобы базальная мембрана hAM была обращена правой стороной вверх в вставке для культуры, и отсоедините последние два зажима. Затем с помощью стерильных ножниц при необходимости обрезайте любую мембрану за пределами вставки для культуры. И используйте щипцы для переноса мембраны в одну лунку 12-луночной пластины, содержащую PBS для хранения при 37 градусах Цельсия и 5% CO2.

Перед посевом нагрейте криопробирки, содержащие от одной до 10 до шестой клеток RPE в 3 мл среды RPE в одной конической пробирке объемом 15 мл на флакон. Когда клетки оттают, пипетку для получения одиночных клеточных суспензий в каждой из пробирок и подсчитайте количество жизнеспособных клеток с помощью исключения трех синих чашек. Соберите клетки центрифугированием и повторно суспендируйте гранулы в концентрации от семи до 10 до 10 до 5 клеток на миллилитр в свежей среде RPE.

Затем аспирируйте PBS из каждой лунки подготовленной 12-луночной пластины и добавьте 500 микролитров клеток в центр каждой культурной вставки и 1 мл среды RPE на дно каждой лунки. Затем верните планшет в инкубатор для клеточных культур на 30 дней, меняя среду два раза в неделю до окончания культивирования. На 30-й день культуры подогрейте 8%-ный раствор желатина на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.

И заполните внутреннюю камеру вибратома независимой средой CO2 с температурой четыре градуса Цельсия. Используйте скальпель, чтобы вырезать блок размером 5 см на 5 см из 20% желатинового блока, хранящегося при температуре четыре градуса Цельсия. Закрепите верхнюю сторону блока на опоре с помощью соответствующего клея.

И поместите новое лезвие в вибратом. Отрегулируйте блок до тех пор, пока он не окажется на том же уровне, что и лезвие бритвы, и наполните ванну вокруг опоры свежей средой, независимой от CO2 четырех градусов Цельсия. Режьте блок со средней скоростью до тех пор, пока блок не будет равномерно разрезан с гладкой ведущей поверхностью, и установите положение в нулевое положение.

Затем отсасывайте среду вокруг желатина до полного высыхания желатина. И с помощью щипцов осторожно откройте вставку, засеянную культурой СИЗОД, поверх блока. С помощью ножниц удалите всю мембрану за пределами кольца вставки и отасуньте весь объем остаточной среды.

Добавьте до 1 мл 8% жидкого желатинового раствора к мембране до полного ее покрытия. И аккуратно удалите излишки желатина. Через пять-восемь минут добавьте в ванну свежую независимую среду CO2 при четырех градусах Цельсия, пока не покроется затвердевающая мембрана.

И с помощью вибратома в положении 100 микрон разрежьте участок мембраны со средней скоростью, заботясь о сохранении ориентации ткани. Разрежьте угол сечения скальпелем, чтобы можно было определить ориентацию сечения. И с помощью шпателя перенесите залитую желатином мембрану на одну из шести луночных пластин, заполненную консервационной средой с температурой четыре градуса Цельсия.

Ориентация среза может быть инвертирована из-за свободного движения перед срезаемым углом. Поэтому позаботьтесь о том, чтобы закрепить положение ломтика сразу после разреза. Размер имплантата затем может быть отрегулирован в соответствии с размером глаза реципиента под хирургическим микроскопом перед трансплантацией.

Как правило, после фиксации на культуральной вставке на поверхности мембраны остается несколько мертвых клеток, но эти клетки удаляются при смене питательной среды. Волокна базальной мембраны видны при более высоком увеличении, когда не осталось клеток, что указывает на то, что период лечения термолизином был оптимизирован. Эпителий сетчатки становится легче увидеть под микроскопом, по мере созревания, образуя полный монослой, похожий на булыжник, уже через три недели.

Через четыре недели эпителий достаточно зрелый, чтобы его можно было подготовить к имплантации. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что состояние желатина зависит от температуры. Поэтому следите за тем, чтобы строго соблюдать рекомендуемый температурный режим.

После своего развития этот метод открывает путь исследователям в области терапии стволовыми клетками к изучению терапевтического потенциала биоинженерной ткани на животной модели пигментного ретинита. Хотя этот метод может быть использован для подготовки ткани поверх каркаса, для его последующей трансплантации, он также может быть применен к более сложным системам, содержащим слои фоторецепторов. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности из-за трудностей в обращении с амниотическими оболочками человека, которые очень тонкие и имеют тенденцию легко сворачиваться.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы фиксации амниотической мембраны человека и встраивания желатина сложны в освоении и требуют особого подхода к обращению.