Всеобъемлющая оценка эффективности и безопасности препарата плаценты целевой доставки с помощью трех взаимодополняющих методов

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области наномедицины об эффективности и безопасности лекарств, содержащих наночастицы, которые доставляются матери и плоду. Основное преимущество данной методики заключается в том, что она способствует точному биохимическому измерению количества препарата, доставляемого в плаценту. Применение этого метода распространяется на терапию осложнений беременности, опосредованных плацентой, потому что важно обеспечить точное нацеливание доставки лекарства к плаценте.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как высокочастотная ультразвуковая оценка эмбрионального развития требует терпения и опыта для освоения. Для внутривенного введения наночастиц перенесите беременную мышь на эмбриональный день 14,5 дня с тепло расширенными хвостовыми венами в ограничитель и очистите хвост спиртовым тампоном. Затем введите кончик иглы инсулинового шприца 28-го калибра в расширенную хвостовую вену и медленно нажимайте на поршень в течение 5-10 секунд с равномерным давлением, чтобы доставить наночастицы в хвостовую вену.

Через 30 минут после инъекции поместите беременную мышь, находящуюся под наркозом, в камеру визуализации системы флуоресцентной визуализации in vivo в положении лежа на спине. Выберите 2D флуоресценцию и соответствующие фотографические параметры для отображения сигналов индоцианиновой зеленой флуоресценции, а также установите экспозицию на авто и длины волн возбуждения и излучения на 710 и 820 нанометров соответственно. Затем представьте животное и верните беременную мышь в клетку.

Через 48 часов после инъекции используйте щипцы Грефе, тканевые щипцы Грефе и ножницы для препарирования для сбора плодов и плаценты, а также визуализируйте собранные ткани так, как будто они только что продемонстрированы всему животному. Для высокочастотной ультразвуковой оценки эмбрионального развития, через 24 часа после введения наночастиц, закрепите беременную дамбу под наркозом на предварительно нагретой платформе ультразвуковой визуализации с температурой от 37 до 42 градусов Цельсия в положении лежа на спине и поместите датчик с частотой 40 мегагерц в механическую руку. Затем отрегулируйте положение датчика для получения продольных изображений плода и плаценты с областью интереса в пределах фокальной зоны.

Для визуализации и анализа в В-режиме выберите В-режим и опустите датчик на брюшную полость, пока в поле зрения не появятся плод и плацента. Нажмите «Сканировать/Заморозить», чтобы начать и остановить изображение, «Кинохранилище», чтобы сохранить цикл кино, и «Хранилище кадров», чтобы сохранить изображения кадра. Затем нажмите «Измерить», чтобы проанализировать длину гестационного мешка, длину крестца коронки плода, битеменный диаметр, окружность живота, диаметр плаценты и толщину плаценты.

Для допплеровской визуализации и анализа пульсовой волны с использованием той же проекции сканирования сначала нажмите «Цвет», затем выберите «Пульсовая волна» и поместите поле объема выборки в центр пупочной артерии. Нажмите «Сканировать/Заморозить», чтобы начать визуализацию, и «Cine Store», чтобы получить изображения пупочной артерии. Затем нажмите «Измерить», чтобы рассчитать пиковую скорость пупочной артерии.

Для получения изображений и анализа в режиме цветного допплера с использованием той же проекции сканирования нажмите кнопку Цвет и отрегулируйте положение датчика, чтобы получить изображения сердца плода, как показано на рисунке. Затем нажмите «Измерить», чтобы рассчитать частоту сердечных сокращений плода для сохраненной петли изображения кино. Для анализа жидкостной хроматографии высокого давления, или ВЭЖХ, сначала введите эмбриональной мыши на 14,5-й день беременности одну дозу наночастиц, как показано на рисунке.

Через 24 часа перфузируйте сердце беременного животного 50 миллилитрами ледяного 0,9% физиологического раствора в течение 10 минут, чтобы удалить все несвязанные наночастицы, и соберите плод и плаценту для хранения при температуре минус 80 градусов по Цельсию. В день анализа добавьте 500 микролитров свежеприготовленного раствора гомогенизации в каждый 200-миллиграммовый образец ткани и гомогенизируйте образцы два раза на полной скорости в течение 30 секунд на каждую диссоциацию. После второй гомогенизации образцы центрифугируют и фильтруют надосадочную жидкость через шприцевой фильтр толщиной 0,45 мкм во флакон ВЭЖХ.

Поместите флаконы с образцами в лоток автосамплера для инъекций и включите дегазатор ВЭЖХ, чтобы удалить воздух из системы. Далее включите поток, чтобы уравновесить колонну с подвижной фазой на 30 минут для снижения базового шума, и установите температуру колонки на 25 градусов Цельсия. Затем введите 20 микролитров образцов со скоростью потока один миллилитр в минуту в течение 30 минут и нажмите «Запустить метод», чтобы начать анализ.

Когда прогоны будут завершены, вручную измените подвижную фазу на ацетонитрил ВЭЖХ и запустите ацетонитрил в течение примерно 15 минут для защиты системы. Визуализация in vivo выявляет сильные зеленые сигналы индоцианина в ткани матки через 30 минут после введения флуоресцентных наночастиц, связанных с хондроитином сульфатом, в то время как несвязанные наночастицы в основном локализуются в печени и селезеночной области. Через 48 ч после инъекции флуоресцентный сигнал наблюдается в плаценте у животных, которым вводили животные, введенные наночастицами, связанными с хондроитинсульфатом, при этом внутри плода сигналы не обнаруживаются.

Высокочастотный ультразвуковой мониторинг плацентарных животных, введенных с флуоресцентными конъюгированными наночастицами хондроитин сульфата, показывает значительное снижение ключевых показателей развития плода и плаценты. Интересно, что обработка наночастицами, связанными с метотрексатом, также незначительно ухудшает развитие плода и плаценты, указывая на то, что наночастицы могут улучшить доставку метотрексата в плаценту за счет улучшенной проницаемости и удерживающего эффекта. Измерение концентраций метотрексата с помощью ВЭЖХ показывает время удержания в плаценте мышей, которым вводили связанные с метотрексатом наночастицы, в течение семи минут.

Через 24 часа после инъекции плацентарные уровни метотрексата в группе, в которой вводили связанные с метотрексатом наночастицы, значительно ниже, чем в группе плацентарных хондроитин сульфата и связанных с метотрексатом наночастиц, при этом метотрексат не обнаруживался у плодов последних. Метотрексат все еще может быть обнаружен в плаценте через 48 часов после инъекции плацентарного хондроитин сульфата и связанных с метотрексатом наночастиц, демонстрируя, что плацентарный хондроитин сульфат и связанные с метотрексатом наночастицы не могут проникать через плаценту, тем самым сводя к минимуму потенциальные неблагоприятные последствия для плода. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что плацента начинает формироваться примерно на 9 1/2 день эмбриона, и поэтому эксперимент с визуализацией in vivo лучше проводить на 10 1/2 день эмбриона или позже.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как иммунофлуоресцентное окрашивание и анализ, чтобы ответить на дополнительные вопросы о локализации наночастиц в плаценте. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области репродуктивной медицины к изучению возможности лечения осложнений беременности с помощью плаценты.