Процедура изоляции на основе олигонуклеотида тандем РНК для восстановления эукариотические мРНК белковых комплексов

Описывается процедура изоляции тандем РНК (поездка) для восстановления эндогенно сформированных мРНК белковых комплексов. Конкретно комплексы РНК белок, сшитыми в естественных условиях, polyadenylated РНК, изолированы от выдержки с oligo(dT) бусы, и частности mRNAs фиксируются с модифицированных олигонуклеотидов Антисмысловые РНК. Белки, привязан к мРНК распознаются immunoblot анализа.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области регуляции экспрессии генов, например, как РНК-связывающие белки собираются на определенных РНК in vivo и тем самым навязывают посттранскрипционную регуляцию генов. Главное преимущество этой методики заключается в том, что она не нуждается ни в клонировании, ни в генетических манипуляциях. Он может быть адаптирован к любому модельному организму или подвиду.

Чтобы сконструировать олигонуклеотиды, проанализируйте вторичную структуру мРНК или ее фрагмент с помощью онлайн-инструментов. Сначала введите нуклеотидную последовательность в пустое поле, затем в поле «Основные параметры» выберите минимальную свободную энергию и избегайте изолированных пар оснований. В окне «Параметры вывода» выберите интерактивный график вторичной структуры РНК и, наконец, нажмите кнопку «Продолжить».

Появится новое окно, в котором отображается вторичная структура интересующей мРНК. Выберите по меньшей мере три различные последовательности длиной от 21 до 24 нуклеотидов в пределах представляющей интерес мРНК, преимущественно в областях, лишенных обширных вторичных структур и расположенных в 3-праймных нетранслируемых областях. Выбирайте области с соотношением гуанидин/цитозин, близким к 50%, и отсутствием нуклеотидных тандемных повторов, чтобы избежать потенциального образования шпилек или самоотжига.

Вручную сконструируйте олигонуклеотиды 2-прайм-метоксимодифицированной РНК, несущие биотиновую часть на 3-прайм, которые полностью комплементарны выбранным областям в пределах желаемой мРНК-мишени. Используйте подходящий онлайн-инструмент для регулировки температуры плавления гибридов РНК в диапазоне от 60 до 65 градусов и с хорошей сложностью лингвистической последовательности. Используйте инструмент Basic Local Alignment Search Tool для поиска потенциальной кросс-гибридизации ASO с другими мРНК в транскриптоме.

Выберите Nucleotide BLAST, вставьте последовательность в пустое поле и выберите интересующий организм. Оставьте остальные параметры по умолчанию и нажмите кнопку BLAST. Трансфектируйте клетки HEK293 при 70% конфлюенции в 10-сантиметровой чашке для культуры тканей, смешивая два микрограмма репортерного гена с 20 микролитрами реагента для трансфекции и добавляя в клетки.

Поместите клетки в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на 48 часов до сбора урожая. В день сбора извлеките среду с помощью серологической пипетки и быстро промойте клетки дважды 10 миллилитрами PBS, предварительно подогретыми до 37 градусов Цельсия. Далее добавьте в блюдо шесть миллилитров PBS и выложите на лед.

Затем подвергните клетки воздействию ультрафиолетового света со скоростью 100 миллиджоулей на квадратный сантиметр в УФ-сшивателе. После воздействия ультрафиолета соскребите клетки и ПБС и переложите в 15-миллилитровую пробирку. Затем вращайте ячейки при 250 умноженных на g в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.

После удаления надосадочной жидкости с помощью пипетки ресуспендируйте клетки в двух миллилитрах предварительно охлажденного буфера для лизиса, пипетируя вверх и вниз пять или шесть раз, удерживая трубку на льду. Перенесите лизат с помощью пипетки в пятимиллилитровую трубку, помещенную на лед, и окуните ультразвуком в течение трех кругов, состоящих из 20-секундных всплесков с амплитудой 10 микрон с 30-секундными периодами охлаждения на льду. После переноса лизата в двухмиллилитровые пробирки центрифугируйте при 15 000 умноженных на g в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.

Соберите надосадочную жидкость и переложите в новую трубку. Чтобы начать выделение РНК, уравновесьте один миллиграмм магнитных шариков, связанных с олиго(dT), в 500 микролитрах буфера для лизиса. Извлеките трубку из вращателя, поместите ее на магнитную решетку и удалите буфер для лизиса.

Смешайте четыре миллиграмма экстракта белка HEK293 с магнитными шариками, связанными с oligo(dT)25. Энергично перемешайте образцы, затем инкубируйте в течение 10 минут при температуре 25 градусов Цельсия. Поместите трубки на магнитную подставку на 10 секунд, затем удалите надосадочную жидкость.

Держите надосадочную жидкость на льду для последующих раундов восстановления. Добавьте 500 микролитров промывочного буфера А в бусины и завихрите на пять секунд. Соберите бусины с помощью магнита, а затем дважды промойте бусины 500 микролитрами буфера для промывки B.To элюируйте РНК, добавьте 30 микролитров 10-миллимолярного Tris-HCl и инкубируйте пробирку при температуре 80 градусов Цельсия в течение двух минут с непрерывным встряхиванием при 1000 оборотах в минуту.

Перенесите пробирку непосредственно на магнитный стенд и соберите элюат как можно быстрее через 10 секунд или около того, чтобы предотвратить возможное повторное связывание мРНК с шариками при более низких температурах. Элюаты от повторных раундов затем объединяются и могут храниться при температуре минус 80 градусов Цельсия. Чтобы захватить определенные мРНК, добавьте 30 микролитров магнитных шариков, связанных со стрептавидином, в один миллилитр связывающего и промывочного буфера, содержащего 0,1 миллиграмма на миллилитр РНК переноса E.coli.

Уравновесьте на ротаторе в течение одного часа при комнатной температуре. Через час трижды промойте бусины с 750 микролитрами связующего и буфером для стирки. Сделайте трубку вихревой, затем удалите черно-белый буфер, затем снова суспендируйте в 30 микролитрах буфера и держите на льду до использования.

Разведите приблизительно 35 мкг общего белка из ранее полученной поли(А)изоляции в 100 микролитрах связывающего и промывочного буфера, затем добавьте 200 пикомолев соответствующего антисмыслового олигонуклеотида и инкубируйте при температуре 70 градусов Цельсия в течение пяти минут для облегчения отжига. Снимите весь нагревательный блок с устройства и поставьте его при комнатной температуре на 10 минут, чтобы он медленно остыл. Далее добавьте в образец 30 микролитров уравновешенных магнитных шариков, сопряженных стрептавидином, затем инкубируйте смесь в течение 30 минут при температуре 25 градусов Цельсия при постоянном встряхивании при 950 об/мин в миксере.

Поместите трубку на магнитную подставку, удалите надосадочную жидкость и трижды промойте бусины 750 микролитрами предварительно подогретого связующего и промывочного буфера при температуре 55 градусов Цельсия. Добавьте 20 микролитров 10-миллимолярного Tris-HCl и поместите при температуре 90 градусов Цельсия с постоянным встряхиванием при 950 об/мин на 10 минут для элюирования РНК. Через 10 минут поместите трубку в магнитную подставку и сразу же соберите элюат.

Это агарозный гель, используемый для обнаружения мРНК с помощью ОТ-ПЦР с использованием специфических праймеров при захвате олиго(dT) и антисмыслового олигонуклеотида к мРНК p27 из клеточного экстракта HEK293. Также показан контроль без антисмысловых олигонуклеотидов. Входные полосы показывают общую РНК из сшитых клеток.

Кроме того, показаны результаты соревнований с поли(А). Здесь представлен иммуноблот-анализ мРНК-связанных белков с антителами, обнаруживающими антиген человека R, неизвестный РНК-связывающий белок и бета-актин, который является отрицательным контрольным белком. Блоттинг показывает, что антиген человека R был успешно обнаружен в изолятах поли(А)РНК при захвате мРНК p27 антисмысловыми олигонуклеотидами.

Антиген человека R не обнаруживался в контрольных изолятах без антисмыслового олигонуклеотида. Входные полосы показывают белки в экстракте из сшитых клеток, а также результаты конкуренции с поли(А). После этой процедуры можно выполнить другой метод, такой как масс-спектрометрия, для систематического анализа всего образца белка, взаимодействующего с определенной РНК in vivo.

Важно отметить, что TRIP является универсальным подходом, который может быть адаптирован ко всем типам полиаденилированных РНК в организме для понимания динамического расположения белковых взаимодействий РНК. Таким образом, он может быть использован для исследования РНК, контролируемых развитием или связанных с заболеванием, и в конечном итоге может привести к появлению новых мишеней для терапевтического вмешательства.