Визуализация аксональное роста конуса коллапса и раннего амилоида β эффекты в нейронах культивировали мыши
30 октября 2018 г.
Здесь представлен протокол расследовать раннего воздействия амилоид β (значения) в головном мозге. Это показывает, что значения индуцирует Клатрин опосредованный эндоцитоз и распада аксональное роста шишки. Протокол является полезным при изучении раннего воздействия значения на конусы роста axonal и может способствовать предотвращению болезни Альцгеймера.
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследований болезни Альцгеймера, особенно ранние события, связанные с крахом конуса роста. Основным преимуществом этого метода является возможность визуализации и анализа конусов аксонального роста сразу после бета-лечения амилоидом. Начните с использования микро-ножниц, чтобы фарш свежеиспеченные кортики головного мозга от эмбриональных мышей день-14 в среде культуры нейронов без антибиотиков.
Соберите ткани и центрифугу тканей при 87G в течение трех минут. После центрифугации удалите супернатант и добавьте в гранулы два миллилитра по 0,05%трипсина. Инкубировать в течение 15 минут при 37 градусах по Цельсию и смешивать, нажав каждые пять минут.
Через 15 минут добавьте четыре миллилитров среднего А, чтобы нейтрализовать трипсин, и перемешайте, нажав. Затем центрифуга тканей в 178 раз G в течение трех минут. После удаления супернатанта добавьте раствор ингибитора ДНК и сои трипсина и инкубировать в течение 15 минут при 37 градусах по Цельсию с смешиванием каждые пять минут, как и раньше.
По протяжённое время добавьте четыре миллилитров среднего A.Mix и центрифуги, как раньше. После удаления супернатанта добавьте четыре миллилитров среднего А и тритуратайте ткани полированной пипеткой Pasteur до тех пор, пока не будет обнаружен мусор. Затем отфильтруй тритурированные ткани сеткой размером с 70 микрон.
После фильтрации подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и рассчитайте плотность клеток. Pipette 0.8 времен 10 к четвертым клеткам в средств a в каждый колодец скольжения культуры 8-хорошо. Затем инкубируют во влажной атмосфере 10%CO2 при 37 градусах Цельсия.
После четырех часов культивирования, изменить культуру среды до среднего B.Чистота нейронов с помощью этого метода составляет около 75%Начните этот анализ по крайней мере за неделю до, открыв свежий флакон коммерчески полученных полнометражных бета 42 и растворения содержимого в стерильной, дистиллированной воды в концентрации 0,5 миллимоляра. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение семи дней, чтобы вызвать агрегацию и токсичность. Подготовка aliquots агрегированных бета 1-42 и хранить при температуре минус 80 градусов по Цельсию до использования.
На четвертый день нейрональной культуры, лечить скважины с 100 микролитров 0,5 микромолара агрегированных бета 1-42 или транспортного средства решения в средней B в течение одного часа, как было продемонстрировано ранее. После того, как час прошел, удалить культуру среды и сразу же исправить нейронов с 4%paraformaldehyde содержащие 4%сахарозы в PBS в течение одного часа при 37 градусов по Цельсию на горячей пластине. Фиксация является наиболее важным, поскольку поддержание формы конусов роста имеет решающее значение для этого протокола.
После фиксации, мыть нейроны три раза с PBS. Затем после удаления камеры, смонтировать нейроны с aqueous монтажа среды. Высушите монтажную среду при четырех градусах по Цельсию в течение двух-четырех дней.
Захват всей площади каждой хорошо с 20X сухой объектив цели на перевернутый микроскоп. Захват и анализ всей области в каждой хорошо имеет важное значение для избежания субъективности. Классифицифиция самых длинных невритов каждого нейрона в стадии три или четыре, как аксоны.
Axonal конусы роста не хватает lamellipodia или обладающих менее трех филоподии считаются рухнул конусов роста. Бета 1-42 олигомеры, показанные здесь до инкубации, агрегируются после семи дней инкубации при 37 градусах по Цельсию. После лечения агрегированной бета 1-42, иммуностимулятор с антителом для токсичных олигомер бета показывает положительное окрашивание в красном на бета 1-42 обработанных нейронов, но не автомобиль лечение нейронов.
Ранние явления, вызванные бета-1-42 лечения были проанализированы после четырех дней в культуре. Выявленные аксоны были подтверждены как таковые положительным иммуностимулированием для аксонального маркера tau-1, показанного красным и отрицательным иммуностимулированием для дендритного маркера, MAP-2, показанного зеленым цветом. После одного часа лечения транспортного средства, рост конусов распространилась lamellipodia и несколько филоподии.
Они были определены как здоровые конусы роста. И наоборот, один час бета 1-42 лечения привело к сморщенный рост конусов, которые разработали не lamellipodia или филоподии. Они были определены как рухнувшие конусы роста.
При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы исправить клетки с 4%PFA и 4% сахарозы при 37 градусов по Цельсию, чтобы мой-nor-idge этот протокол фиксации в лучшем случае. Следуя этому протоколу, другой метод, такой как живая клеточная визуализация и трансфекция генов, может быть выполнен, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как, когда и как конусы роста аксона рухнули и как рухнувшие конусы роста восстанавливаются.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол, предназначенный для оценки раннего воздействия амилоида-β (Aβ) на аксональные конусы роста нейронов. В исследовании используются коры головного мозга эмбрионов мышей, демонстрируя, что Aβ индуцирует клатрин-опосредованный эндоцитоз и приводит к коллапсу конусов роста. Данная работа имеет важное значение для понимания ранних механизмов, которые могут способствовать развитию болезни Альцгеймера.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Исследование болезни Альцгеймера
Обзор
- Aβ задействован в патогенезе болезни Альцгеймера, в частности в дегенерации нейронов.
- Понимание воздействия Aβ на нейроны может дать важные сведения о прогрессировании болезни Альцгеймера.
- Коллапс конусов роста аксонов является ранним событием при повреждении нейронов.
- Данное исследование предоставляет необходимую методологию для визуализации и анализа этих изменений в ответ на воздействие Aβ.
Цель исследования
- Изучение механизмов влияния Aβ на конусы роста аксонов.
- Содействие пониманию ранних патофизиологических событий при болезни Альцгеймера.
- Разработка протокола для наблюдения за непосредственным воздействием Aβ на структуру нейронов.
Используемые методы
- В исследовании используется платформа клеточного культивирования с нейронами, полученными из коры головного мозга эмбрионов мышей на 14-й день развития.
- После изоляции нейроны обрабатывают агрегированным Aβ для оценки его влияния на конусы роста.
- Основные этапы включают подготовку и инкубацию нейрональных культур с последующей фиксацией и иммуноокрашиванием для анализа морфологии конусов роста.
- В протоколе указано критическое время инкубации для агрегации Aβ и сроки обработки нейрональных культур.
- Наблюдения проводятся с помощью микроскопии для классификации конусов роста на основе их структурных характеристик.
Основные результаты
- Обработка Aβ привела к коллапсу конусов роста, характеризующемуся отсутствием ламеллиподий и уменьшением количества филоподий.
- Контрольные нейроны демонстрировали здоровую морфологию конусов роста, что существенно отличалось от нейронов, обработанных Aβ.
- Иммуноокрашивание подтвердило аксональную природу отростков и токсическое воздействие Aβ на структуру нейронов.
- Полученные результаты подтверждают гипотезу о том, что Aβ оказывает негативное влияние на развитие нейронов на ранних стадиях.
Выводы
- В данном исследовании представлен ценный протокол для выяснения влияния Aβ на конусы роста аксонов.
- Данная методология позволяет изучить механизмы нейронального ответа на воздействие Aβ.
- Понимание этих ранних изменений в конусах роста может помочь в разработке стратегий профилактики и лечения болезни Альцгеймера.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для индустрии
Данный протокол позволяет на ранних этапах выявить вызванный амилоидом-β коллапс конусов роста аксонов — ключевое механистическое событие, предшествующее синаптической дисфункции при болезни Альцгеймера. Визуализация клатрин-опосредованного эндоцитоза и структурной дегенерации в режиме реального времени способствует валидации мишеней и снижению рисков при разработке механизмов действия нейродегенеративных препаратов. Этот подход предоставляет релевантную патологии модель для оценки терапевтических вмешательств, направленных на блокирование последующей токсичности Aβ до проявления когнитивного дефицита.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет проверить гипотезу о том, что индуцированный Aβ эндоцитоз вызывает коллапс конуса роста, что способствует валидации механистической мишени.
- Операционная ценность: использование иммуноокрашивания на аксональные (tau-1) и дендритные (MAP-2) маркеры для подтверждения нейрональной идентичности и фенотипической специфичности.
- Прогностическая ценность: демонстрирует, что ингибирование эндоцитоза предотвращает токсичность Aβ, предоставляя показатель, подобный биомаркеру, для оценки активации сигнального пути.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: обеспечивает количественные морфологические показатели (наличие ламеллиподий/филоподий) для высокопроизводительного анализа эффектов соединений.
- Воспроизводимость: стандартизированная фиксация 4% PFA и сахарозой сохраняет структуру конуса роста, сводя к минимуму вариабельность при оценке на основе изображений.
- Масштабируемость: совместимость с многолуночными культуральными стеклами позволяет проводить параллельное тестирование агрегатов Aβ и потенциальных ингибиторов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: Моделирует раннюю токсичность Aβ-олигомеров в первичных нейронах мыши, что отражает патофизиологические процессы, предшествующие нарушению памяти.
- Трансляционная преемственность: Связывает аксональную дегенерацию с нарушением сетевого взаимодействия, что обосновывает необходимость раннего вмешательства при болезни Альцгеймера.
- Механистическое снижение рисков: Определяет эндоцитоз как доступный для воздействия лекарственными средствами узел, предшествующий нейродегенерации, что помогает при выборе терапевтической мишени.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум раннего поиска, позволяя получить понимание механизмов действия после воздействия на мишень, но до фенотипического скрининга на сложных моделях заболеваний.
- Открывательная биология: позволяет проверять гипотезы о путях передачи сигналов Aβ посредством прямой визуализации динамики конуса роста.
- Скрининг: обеспечивает получение стандартизированных количественных морфологических данных, подходящих для миниатюризации и автоматизации анализа.
- Аналитика: основана на классификации состояний конуса роста с помощью микроскопии, что позволяет проводить объективное сравнение различных условий обработки.
- Трансляционные исследования: поддерживает оценку соединений, ингибирующих эндоцитоз или предотвращающих коллапс цитоскелета, в соответствии с биомаркерами.
- Корпоративное повторное использование: создает универсальную платформу для изучения олигомеров Aβ и других нейротоксикантов в первичных культурах нейронов.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность путем установления связи между воздействием Aβ и определенными изменениями цитоскелета в конусах роста.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизированные рабочие процессы визуализации, зависящие от фиксации, которые совместимы с существующей инфраструктурой нейробиологии.
- Стратегическая ценность: Помогает в принятии решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») путем идентификации соединений, блокирующих ранние структурные повреждения, индуцированные Aβ.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритезацию терапевтических средств, нацеленных на пресинаптические механизмы при болезни Альцгеймера, с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с первичными культурами нейронов, иммуноокрашиванием и флуоресцентной микроскопией.
- Необходим доступ к инвертированным микроскопам, гемоцитометрам и камерам для культивирования (10% CO2, 37°C).
- Необходимы стандартизированные протоколы агрегации Aβ (инкубация в течение 7 дней при 37°C) для обеспечения однородности токсичных олигомеров.
- Требуется оптимизация с учетом степени чистоты нейрональной культуры (~75% в данном протоколе) и возможной вариабельности морфологии конусов роста.
- Метод ограничен конечными анализами, если он не сочетается с визуализацией живых клеток, так как фиксация исключает возможность продольного наблюдения.
