Поколение нокаут-основной и Расширенный человеческого НК-клеток с помощью Cas9 Ribonucleoproteins

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии NK-клеток о роли и функциях конкретных генов и путей, которые регулируют функцию эффекторных клеток. Основным преимуществом этого метода является его высокий процент успеха по сравнению с ДНК-зависимыми подходами, способствующими высокоэффективному нокауту одного из наиболее клинически значимых генов в терапии NK-клетками. Применение этого метода распространяется на иммунотерапию солидных опухолей и опухолей головного мозга, которые экспрессируют TGF-бета в качестве средства ускользания от иммунитета.

Для первичной трансдукции NK-клеток инкубируйте три раза по 10 до пяти свежевыделенных NK-клеток на миллилитр среды RPMI с добавлением 100 МЕ на миллилитр IL2 на колбу T75 в течение четырех дней, заменяя среду через день и за день до трансдукции. Для расширенной трансдукции NK-клеток стимулируйте первичные NK-клетки в нулевой день с помощью облучаемых мембраносвязанных IL21-экспрессирующих K562 фидерных клеток K562 в соотношении один к одному, заменяя среду через день и за день до трансдукции. В день электропорации наполните одну колбу T25 восемью миллилитрами свежей питательной среды с добавлением 100 МЕ на миллилитр IL2 для каждого экспериментального клеточного условия и поместите колбы во увлажненный инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и 5% CO2.

Пока среда уравновешивается, добавьте три-четыре раза по 10-шестую клетки в одно состояние на 26 микролитров трансдукционной смеси в коническую пробирку и гранулируйте клетки центрифугированием. Затем промойте клетки три раза в 12 миллилитрах стерильного PBS за одну промывку, чтобы удалить всю FBS из клеточных суспензий. Пока клетки промываются, ресуспендируйте каждую CRISPR РНК и тракрРНК до 200 микромолярных конечных концентраций.

Смешайте 2,2 микролитра каждой РНК CRISPR с одним 200 микромолярным объемом тракрРНК на образец и нагрейте образцы при температуре 95 градусов Цельсия в течение пяти минут. Затем дайте образцам остыть до комнатной температуры и храните комплексы CRISPR РНК/тракрРНК при температуре минус 20 градусов Цельсия до их использования. Для образования рибонуклеопротеиновых комплексов добавляют эндонуклеазу Cas9 к соответствующему комплексу CRISPR РНК/тракрРНК с закручиванием в течение 30-60 секунд и инкубируют полученные рибонуклеопротеиновые комплексы Cas9 при комнатной температуре в течение 15-20 минут.

После последней промывки добавьте весь объем добавки для электропорации из набора Nucleofector solution P3 и ресуспендируйте каждую клеточную гранулу в 20 микролитрах первичного раствора P3 4D-Nucleofector, стараясь избегать образования пузырьков воздуха. Немедленно добавьте по пять микролитров каждого рибонуклеопротеинового комплекса в соответствующую клеточную суспензию и добавьте один микролитр 100 микромолярного усилителя электропорации Cas9 в клеточную смесь комплекса рибонуклеопротеинов Cas9. Перелейте 26 микролитров клеточного раствора рибонуклеопротеина Cas9 в отдельные лунки полоски Nucleocuvette и осторожно постучите по полоске, чтобы убедиться, что образцы покрывают дно каждой лунки.

Затем запустите программу 4D-Nucleofector system EN138. По окончании трансдукции дайте клеткам отдохнуть в течение трех минут. Затем добавьте по 80 микролитров предварительно уравновешенной питательной среды в каждую кювету и аккуратно переложите образцы в одну колбу на одно условие при инкубации при 37 градусах Цельсия.

После 48 часов культивирования извлеките геномную ДНК от пяти до пяти трансдуцированных клеток для скрининга делеции генов в соответствии со стандартными протоколами. Затем стимулируйте остальные трансдуцированные клетки свежими, связанными с мембраной IL21-экспрессирующими фидерными клетками в соотношении один к одному и экстрагируйте РНК после пяти дней совместного культивирования в соответствии со стандартными протоколами анализа экспрессии генов методом количественной ПЦР. Анализ проточной цитометрии показывает, что программа EN138 приводит к наивысшему проценту жизнеспособности клеток и эффективности трансдукции среди доступных программ системы Nucleofector.

Например, с помощью коммерчески предоставленных направляющих РНК человеческий HPRT1 успешно нокаутируется в расширенных NK-клетках человека. Кроме того, рибонуклеопротеины Cas9, содержащие направляющую РНК2, направляющую РНК1 плюс направляющую РНК2 и направляющую РНК3, демонстрируют успешный нокаут гена второго эктодомена рецептора TGF-beta, в то время как направляющая РНК1 сама по себе не индуцирует какие-либо обнаруживаемые делеции инсерции T7E1. Действительно, использование программы EN138 для электропорации рибонуклеопротеинов Cas9 приводит к снижению экспрессии двух мРНК рецептора TGF-beta на 60% в клетках, трансдуцированных с помощью этой программы.

Кроме того, совместное культивирование трансдуцированных клеток с TGF-бета и линией первичных клеток медуллобластомы человека не оказывает существенного влияния на цитотоксичность NK-клеток по сравнению с контрольными трансдуцированными клетками, не обработанными TGF-бета, что приводит к соответствующему отсутствию функции второго рецептора TGF-бета в модифицированных клетках Cas9 рибонуклеопротеина на белковом уровне. После освоения этой техники ее можно выполнить за пять часов, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о разработке нескольких различных направляющих РНК, чтобы найти наилучший результат редактирования генов.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как секвенирование ДНК или анализ мутации T7E1, чтобы ответить на дополнительные вопросы об эффективности редактирования генов или о том, как определить потенциальные генетические мутации, не являющиеся мишенью. После своего развития этот метод проложил путь для исследователей в области иммунотерапии рака, чтобы изучить потенциал использования NK-клеток с редактированием генов в лечении рака. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выполнять редактирование генов первичных NK-клеток человека.

Для получения дополнительной информации о расширении NK-клеток после этого процесса, пожалуйста, ознакомьтесь с нашей предыдущей статьей о Юпитере. Не забывайте, что работа с человеческой кровью может быть чрезвычайно опасной, и что при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать универсальные меры предосторожности для здоровья и безопасности.