Характеристика микрофлора клеща, следующего поколения 16S рРНК ампликон последовательности

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области экологии трансмиссивных заболеваний, такие как: какую роль играет микробиом вектора в динамике патогенов, а также как формируются и изменяются микробиомы векторов? Основные преимущества этого метода заключаются в том, что он обеспечивает высокую воспроизводимость, а также высокое разрешение и идентификацию, что позволяет пользователю точно охарактеризовать векторный микробиом в различных экологических и экологических условиях. Визуальная демонстрация этого метода важна, так как этапы настройки секвенирования микробиома сложны для изучения, и существует множество различных продуктов и методов, но мало доступных ресурсов для изучения этих шагов.

Начните эту процедуру со сбора клещей, как описано в текстовом протоколе. Чтобы удалить поверхностные загрязнения от клещей, добавьте 500 микролитров перекиси водорода, и сделайте вихрь в течение 15 секунд. Повторите эту промывку с 70% этанолом, а затем дважды дистиллированной водой.

Поместите клещей в новую пробирку для ПЦР и дайте им высохнуть на воздухе. В этой трубке механически разрушают ткани клещей, раздавливая клещей смертным и пестиком. Очистите ДНК от отдельных клещей, следуя инструкциям, содержащимся в коммерчески доступном наборе для извлечения ДНК.

Разбавьте до конечного объема 100 микролитров. Создание отрицательного контроля на этапе экстракции имеет решающее значение для последующей дифференциации предполагаемых загрязнителей от истинных векторных микробов. Использование стерильной техники на этапе экстракции и на последующих этапах ПЦР также необходимо для минимизации влияния загрязнения, характерного для секвенирования 16S.

Проводят ампликоновую ПЦР в реакции объемом 27,5 мкл, содержащей по пять микролитров каждого праймера на одном микромоляре и 12,5 микролитров коммерчески доступной смеси для ПЦР. Также включите пять микролитров ДНК, извлеченных из отдельных клещей в концентрации пять нанограммов на микролитр. Переместите трубки в термоамплификатор и запустите программу, указанную в текстовом протоколе.

После завершения ПЦР визуализируйте продукт ПЦР, загрузив от четырех до шести микролитров на образец в 1,5%-ный агарозный гель. Ищите полосу на 460 парах оснований, чтобы подтвердить усиление. Используя новую пробирку для ПЦР для каждого образца, соедините продукт ПЦР с водой двойной дистилляции, чтобы получить в общей сложности 60 микролитров.

Для образцов с низкой концентрацией ДНК проведите ампликонную ПЦР в трех экземплярах, чтобы уменьшить систематическую ошибку амплификации, и объедините образцы для концентрации. Доведите парамагнитные шарики до комнатной температуры и хорошо закрутите их перед использованием. Добавьте 48 микролитров парамагнитных шариков в 60 микролитров образца и инкубируйте в течение пяти минут.

Поместите пробирки на магнитную решетку на пять минут, пока раствор не станет прозрачным. Затем удалите надосадочную жидкость. С помощью трубок на магнитной решетке добавьте 500 микролитров свежеприготовленного 80%-ного этанола.

Сразу после добавления этанола во все пробирки, пипеткой вылейте жидкость, шарики не удаляйте. Повторите добавление и удаление этанола еще раз. Высушите образцы на воздухе, чтобы удалить избыток этанола, оставив пробирки открытыми на магнитной стойке на пять минут или пока в бусинах не станут видны небольшие трещины.

Теперь добавьте 20 микролитров TE-буфера и инкубируйте образцы с магнита при комнатной температуре. Через пять-10 минут поместите трубки обратно на магнит. После того, как шарики и жидкость будут разделены, перенесите надосадочную жидкость в свежую пробирку, чтобы получить очищенный продукт ПЦР.

Назначьте уникальные комбинации праймеров для каждого образца, выбрав либо прямые, либо обратные праймеры, либо оба из имеющегося на рынке библиотечного индексного набора. Чтобы прикрепить двойные праймеры или индексы к образцам, приготовьте ПЦР-реакцию, содержащую 2,5 микролитра каждого праймера, 12,5 микролитров коммерчески доступной смеси PCR Master Mix, пять микролитров воды двойной дистилляции и 2,5 микролитра очищенного продукта ампликона. Переместите трубки в термоамплификатор, запрограммированный в соответствии с текстовым протоколом.

После завершения ПЦР визуализируйте продукт ПЦР, загрузив от четырех до шести микролитров на образец в 1,5%-ный агарозный гель. Найдите полосу на 550 парах оснований, чтобы подтвердить усиление, прежде чем выполнять процедуру очистки, как раньше. Чтобы выполнить точное количественное определение каждого очищенного продукта со штрихкодированием, проведите количественную ПЦР на каждом образце и стандарте в трех экземплярах, а также проверьте каждый образец на трех или более уровнях разбавления.

Приготовьте 10 микролитров реакций количественной ПЦР, содержащих шесть микролитров qPCR Master Mix, два микролитра воды двойной дистилляции и два микролитра образца или стандарта. Переместите планшет для количественной ПЦР на прибор для ПЦР в реальном времени, запрограммированный в соответствии с описанием в текстовом протоколе, и выполните прогон. После количественной оценки создайте объединенную библиотеку, добавив равные объемы всех отдельных библиотек в одну пробирку.

После разбавления и денатурации объединенной библиотеки и системы управления секвенированием загрузите комбинированную смесь в ячейку для секвенирования. Тщательно очистите проточную ячейку перед загрузкой для оптимальной оптики. Затем загрузите проточную ячейку в секвенсор и выполните анализ ампликонной последовательности.

Здесь показаны кривые разрежения для нормализации количества последовательностей. Эти кривые показывают, что разрежения до 2000 последовательностей на выборку должно быть достаточно, чтобы охватить все разнообразие наблюдаемых оперативных таксономических единиц. После разрежения и качественной фильтрации чтения последовательностей выполняется вывод альфа- и бета-разнесения.

Здесь показан автоматически сгенерированный график анализа основных координат, показывающий, как меняется состав микробиома клещей в зависимости от лечения. Кроме того, для всех образцов автоматически создается визуализация микробов, присутствующих в каждом образце, на уровне их типа. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о необходимости стерильной техники, чтобы свести к минимуму эффект микробного загрязнения, которое может критически повлиять на интерпретацию данных секвенции.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как гистологическое окрашивание, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как: где находятся наблюдаемые микробы в векторе? После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области молекулярной экологии к изучению роли микробных взаимодействий внутри вектора и исследованию того, как это может повлиять на передачу патогенов.