Арбовирусных инфекций как скрининг инструменты для выявления вирусной иммуномодуляторов и принимающих противовирусное факторов

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области вирусной иммунологии, такие как какие факторы хозяина ограничивают репликацию арбовируса и, в свою очередь, какие кодируемые вирусом белки уклонения от иммунитета преодолевают эти механизмы рестрикции хозяина. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет использовать упрощенную люминесцентную и флуоресцентную космические анализы для определения клеточных условий, которые позволяют арбовирусам реплицироваться в абортивной инфекции в клетках чешуекрылых насекомых. Поскольку фоновая репликация арбовирусов в клетках чешуекрылых минимальна, становится относительно просто обнаружить условия, которые способствуют репликации арбовирусов.

Для начала поддерживайте клетки LD652 в 10-сантиметровых чашках, обработанных культурой тканей, и пропускайте клетки, когда они достигнут 80% конфлюенции. Пипетки многократно наносят питательную среду на монослой клеток, чтобы вытеснить клетки, затем разбавляют образец в питательной среде до приблизительной плотности 100 тысяч клеток на миллилитр. После этого переложите по одному миллилитру разведенной культуры в каждую лунку 24-луночной пластины.

Затем дайте клеткам осесть в течение как минимум одного часа. За 30 минут до инфекции разморозьте стебли люциферазы VSV и вируса коровьей оспы на льду. Затем разбавьте люциферазу VSV с вирусом коровьей оспы и без него в SFM таким образом, чтобы был достигнут MOI 10 и 25 соответственно.

Отсасывайте зрелые среды LD652 осторожно, чтобы не нарушить монослой клеток, и инокулируйте каждую лунку 0,2 миллилитрами вируса. Затем добавьте стерильный SFM в дополнительные лунки, которые будут служить в качестве фиктивно инфицированных отрицательных контрольных клеток. Инкубируйте клетки в инокуляте в течение двух часов при температуре 27 градусов Цельсия.

Затем удалите инокулянт с помощью аспирации и замените его одним миллиметром питательной среды LD652 в каждой лунке. После этого дайте инфекции протекать еще от 24 до 72 часов. Сначала тщательно отсасывайте надосадочную жидкость и добавляйте в каждую лунку по одному миллилитру DPBS.

С помощью поршня шприца соскребите клетки в DPBS. Затем перенесите ячейки в микроцентрифужную пробирку и центрифугируйте в течение 20 минут при 400-кратной гравитации и четырех градусах Цельсия. Тем временем разведите в пять раз репортерный буфер лизиса в стерильной воде.

После центрифугирования аспирируйте DPBS, не повреждая гранулы. Далее повторно суспендируйте гранулу в 150 микролитрах однократного РЛБ. Затем инкубируйте образец при температуре минус 80 градусов Цельсия с последующим быстрым размораживанием на водяной бане комнатной температуры.

После этого храните лизаты при температуре минус 80 градусов Цельсия для дальнейшего анализа. Разморозьте лизаты на льду и пипеткой влейте 20 микролитров лизата в лунки 96-луночного планшета. Далее добавьте по 100 микролитров области анализа люциферазы в каждую лунку пластины.

Сразу же измерьте интенсивность света с помощью люменометра. В условиях одиночной инфекции клетки LD652 ограничивают репликацию люциферазы VSV. Таким образом, наблюдается лишь небольшой сигнал люциферазы.

Коинфекция, однако, приводит к значительно более высоким сигналам люциферазы. В условиях одиночной инфекции клетки LD652 также ограничивают репликацию dsRED VSV, таким образом, только небольшое количество клеток проявляет сигнал dsRED. Коинфекция вирусом коровьей оспы, однако, приводит к тому, что большинство клеток проявляют сигналы dsRED к концу временного цикла.

Примерно 2% клеток от одной инфекции были dsRED положительными через 65 часов после заражения. Напротив, примерно 77% коинфицированных клеток были положительными на dsRED в тот же момент времени. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить об оптимизации временных точек, в которые будут проводиться анализы люциферазы или визуализации живых клеток, чтобы дать достаточно времени для репликации VSV и производства обнаруживаемого сигнала.

После этой процедуры могут быть проведены другие методы, такие как РНК-интерференцированное нокдаун факторов хозяина, чтобы идентифицировать потенциальные противовирусные факторы хозяина, ограничивающие репликацию арбовируса. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области вирусной иммунологии к определению роли белков A51R, кодируемых вирусом оспы, в стимулировании репликации и патогенеза вируса оспы. Не забывайте, что работа с эукариотическими вирусами может быть чрезвычайно опасной и важно соблюдать надлежащие меры предосторожности, такие как ношение средств индивидуальной защиты во время выполнения этой процедуры.