Высок объём Люцифераза Assay для оценки протеолиза PCSK9 сингл оборот протеазы

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биохимии PCSK9, такие как какие лекарства или генетические изменения влияют на протеолитическую функцию PCSK9. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет быстро и с большим числом считывать биохимические события с низкой частотой. Последствия этого метода распространяются на атеросклеротическую болезнь сердца, потому что протеолитическая функция PCSK9 необходима для его конечного влияния на уровень холестерина в сыворотке крови.

Хотя этот метод может дать представление о самом PCSK9, он также может быть применен к другим биохимическим системам, таким как другие протеазы с низкой протеолитической активностью. Для начала аспирируйте среду из каждой Т-клетки HEK293. Промыть PBS и обработать минимальным объемом 0,5% Трипсин-ЭДТА.

И инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух-пяти минут, чтобы отделить клетки от родительской колбы. Добавьте два тома DMEM с добавлением 10% FBS для инактивации Trypsin-EDTA. Затем пипеткой втягивайте жидкость в колбу вверх и вниз несколько раз, вытесняя прилипшие клетки и перенося клетки в стерильную пробирку.

Далее удаляем небольшую аликвоту ячеек. Окрасьте таким же объемом Trypan Blue и перенесите окрашенные клетки на предметное стекло, а также используйте автоматический счетчик клеток для подсчета ячеек. Центрифугируйте пробирку при 500-кратном перегрузке в течение пяти минут, чтобы восстановить клетки.

После этого аспирируйте среду и восстановите клетки и питательную среду до желаемой концентрации. С помощью многоканальной пипетки и стерильного корыта перенесите 100 микрометров клеток из каждой лунки на белую 96-луночную пластину. Затем инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение 24 часов.

Затем подготовьте планшет с плазмидами до желаемой концентрации для трансфекции, включая четыре лунки для плазмиды положительного контроля, плазмиды отрицательного контроля и буфера без плазмид. Сначала приготовьте мастер-смесь из разведенного реагента для трансфекции липидов и мастер-смесь реагента для предварительного комплексообразования ДНК. Затем с помощью многоканальной пипетки и стерильного корыта внесите 16,8 микролитров реагента для предварительного комплексообразования разбавленной ДНК в каждую лунку планшета для глубоких лунок.

После этого с помощью многоканальной пипетки передайте 3,2 микролитра каждой плазмиды с мастер-планшета в каждую лунку глубоколуночной пластины. Затем с помощью пипетки добавьте 20 микролитров разбавленной смеси реагентов для трансфекции липидов в каждую лунку пластины и тщательно перемешайте. Накройте пластины крышками и дайте им постоять при комнатной температуре от 10 до 15 минут, чтобы образовались комплексы липидной ДНК.

После этого с помощью многоканальной пипетки аккуратно удалите среду из 293 Т-клеток в 96-луночном планшете. Затем замените среду 95 микролитрами DMEM с добавлением 10% FBS. Затем с помощью многоканальной пипетки добавьте 10 микролитров смеси для переливания в каждую подходящую лунку.

Затем инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение 24 часов. Во-первых, приготовьте исходные растворы, необходимые для изготовления реагента для анализа коэлентеразина двойной силы, включая три моляра аскорбата натрия в PBS, пять моляров хлорида натрия в дистиллированной воде, 10 мг на миллилитр BSA в PBS и два миллимолляра коэлентеразина в подкисленном метаноле. Затем приготовьте достаточное количество реагентов для реагентов на основе люциферазы.

С отдельным реагентом каждый для клеток в Среде. Затем смешайте все реагенты, ожидаемые для клеэнтеразина. Отфильтруйте смесь через шприц-фильтр 0,22 микрометра.

А затем после фильтрации добавьте кишечник. Извлеките клетки из инкубатора через 24 часа после трансфекции. Затем с помощью многоканальной пипетки перекачайте 50 микролитров кондиционированной среды из каждой лунки на свежую белую 96-луночную пластину.

С помощью многоканальной пипетки добавьте 50 микролитров нелитического реагента с коэлентеразином двойного действия на пластину, содержащую только кондиционированную среду. Затем аккуратно встряхните тарелку в темноте в течение пяти-10 минут при комнатной температуре. Затем повторите этот шаг, добавив реагент литического коэлентеразина двойной силы на пластину, содержащую клетки.

После инкубации измерьте люминесценцию планшета, предназначенного только для среды, и планшета, содержащего клетки, в считывателе планшетов. Наконец, выбросьте пластины и сохраните файлы для дальнейшего анализа данных. Важно инкубировать реагент люциферазы с планшетом, предназначенным только для среды, и планшетом, содержащим клетки, в течение одинакового периода времени, поскольку данные для этих планшетов напрямую сравниваются.

В этом протоколе специфичность последовательности расщепления протеазы PCSK9 на сайтах субстрата P6 - P6 Prime оценивали с помощью анализа люциферазы. Изменения в последовательности расщепления в положениях P6 и P4 через P1 Prime плохо переносятся протеазой. Но позиции P5 и P2 Prime через P6 Prime более гибки для изменения.

Кроме того, результаты показывают, что оптимальные последовательности спайажа по сути такие же, как и последовательности типа Wild. Относительная активность расщепления библиотеки неверных ножниц, обнаруженных в клинике, была сравнена с протеазой дикого типа. Из 84 оцененных фрагментов более половины продемонстрировали значительные изменения в активности по сравнению с протеазой дикого типа, что позволяет предположить, что изменения в активности протеазы часто наблюдаются в клинической популяции.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как проточная цитометрия или анализ поглощения холестерина в гепатоцитах, для оценки изменений протеолитической способности PCSK9 на влияние PCSK9 на рецептор ЛПНП.