ADIPO ясно: Ткани, очистка метод для трехмерных изображений жировой ткани

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии жировой ткани, например, как различные компоненты жировой ткани взаимодействуют во всей ткани. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она полностью удаляет избыток липидов, хранящихся в жировой ткани, сохраняя при этом ее трехмерную архитектуру. В то время как этот метод может дать представление о трехмерной организации жировой ткани, он также может быть применен к другим тканям с высоким содержанием липидов, таким как железы памяти и лимфатические узлы.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы делипидации и очистки требуют достаточного времени инкубации, которое может быть трудно определить. Начните с использования щипцов с тупым концом, чтобы препарировать интересующий вас жировой пакет от только что обработанной животной модели. Аккуратно удалите всю подушечку, не зажимая и не сдавливая ткань и не загрязняя рассеченную ткань мехом.

Поместите жировую подушку примерно в 10 миллилитров фиксирующего раствора в коническую трубку объемом 15 миллилитров и закрепите при температуре четыре градуса Цельсия на ночь. На следующий день после промывки образца PBS аккуратно удалите из образца любой мусор под микроскопом для вскрытия. Волосы, ворсинки или другой мусор, прикрепленный к образцу, будут вызывать тени во время визуализации.

Перенесите чистый образец в полипропиленовую пробирку, содержащую ледяной 20-процентный буфер метанола B1N. Поместите пробирку с образцом горизонтально на орбитальный встряхиватель, установите его на 100 оборотов в минуту и встряхивайте от 30 минут до 1 часа в зависимости от размера образца. Убедитесь, что образцы могут свободно перемещаться внутри пробирки.

Продолжайте обезвоживание образцов с помощью градуированной серии 40 процентов, 60 процентов и 80 процентов метанола в буфере B1N, а затем 100 процентов метанола. Сведите к минимуму решение о переносе остатков. После обезвоживания замените 100-процентный раствор метанола на 100-процентный дихлорметан или ДКМП, чтобы удалить жидкость из образца.

Повторите промывку дважды в соответствии со временем инкубации, указанным в таблице 2. Образец должен опуститься на дно пробирки в конце второй и третьей промывки DCM. Если нет, увеличьте время инкубации, чтобы обеспечить полную делипидацию.

После обезжиривания дважды промыть 100-процентным метанолом в течение времени, указанного в таблице 2. Регидратируйте образец в обратном буферном ряду метанола B1N в течение времени, указанного в таблице 2. После регидратации промыть образец буфером PTXWH в течение 2 часов при комнатной температуре.

Теперь образец готов к иммуноокрашиванию или может храниться в буфере PTXWH при температуре 4 градуса Цельсия в течение 1 года. Во-первых, разведите первичное антитело в буфере PTXWH до рекомендуемой концентрации. Затем центрифугируют разведенный раствор антител при концентрации 20 тыс. G в течение 10 минут, чтобы предотвратить введение преципитатов или агрегаций антител.

Важно выбрать правильные первичные антитела, совместимые с метанолом и лечением ДКМП. Новые антитела должны быть валидированы с помощью небольших кусочков ткани или обработанных метанолом срезов ткани. Инкубируйте делипированный образец с первичным раствором антител в течение 3–5 дней в зависимости от размера образца.

После первичной инкубации промывают образец с несколькими заменами буфера PTXWH. На следующий день разведите вторичное антитело в буфере PTXWH до рекомендуемой концентрации. Разбавленный раствор антител центрифугировать, как и раньше.

Инкубируйте образец с раствором вторичного антитела в течение 3–5 дней в зависимости от размера образца. Снова промойте образец буфером PTXWH в серии этапов инкубации, как и раньше. На следующий день промойте пробу 1XPBS в течение 5 минут, 10 минут, затем 30 минут.

Заложите жировую ткань в агарозу для облегчения монтажа образца для световой листовой микроскопии. Сначала приготовьте заделочный раствор с 1-процентной агарозой в 1XPBS. Охладите закладочный раствор примерно до 40 градусов Цельсия, чтобы не подвергать образец чрезмерному нагреванию.

Избегая уноса жидкости, поместите очищенный образец ткани в форму и установите ее в нужное положение. Затем аккуратно вылейте раствор для встраивания на образец, избегая образования пузырьков воздуха. Любые пузырьки воздуха следует переместить на периферию до того, как агароза застынет.

Как только агароза полностью застынет, вырежьте блок, содержащий образец. Поместите образец в воду с содержанием метанола 25 процентов, защитите от света и инкубируйте с встряхиванием в течение времени, указанного в таблице 2. Продолжайте обезвоживание образца с помощью градиента метанола.

Инкубируйте образец в 100-процентном DCM в течение 1 часа с встряхиванием. Промытые образцы DCM легко высыхают на воздухе, что может повлиять на четкость образца и привести к размытию изображения. Важно быстро перелить образцы в свежий раствор, чтобы предотвратить высыхание.

Образец должен опускаться на дно пробирки в конце каждой промывки DCM. Инкубируйте образец в дибензиловом эфире или ДБЭ в течение ночи с легким встряхиванием для достижения согласования показателя преломления. Образец со временем станет прозрачным, невидимым светом.

На следующий день, после инкубации образца со свежим ДБЭ с легким встряхиванием в течение 2 часов, храните образец при комнатной температуре в темноте или приступайте непосредственно к визуализации. Чтобы получить изображение образца с помощью светового листового микроскопа, совместимого с DBE, установите заболоченный образец агарозы на держатель, который может предотвратить движение во время визуализации. Чтобы получить изображение образца с помощью инвертированного конфокального или двухфотонного микроскопа, поместите залитый агарозой образец в предметное стекло со стеклянным дном.

Сканирование заднего подкожного жирового пакета с помощью светового листового микроскопа с малым увеличением показывает дольковую организацию адипоцитов. Более подробную информацию, такую как размер адипоцитов, можно получить, увеличив интересующие области с большим увеличением. Задний подкожный жировой пакет, окрашенный тирозингидроксилазой, маркером симпатической нервной системы, был визуализирован с помощью световой флуоресцентной микроскопии.

При окрашивании TH были выявлены структуры, которые выглядят как большие нервные пучки, как показано стрелкой. Иннервация кровеносных сосудов, а также плотная терминальная арборизация в ткани паренхимы также выявляются при окрашивании ТГ. Используя молекулу адгезии эндотелиальных клеток тромбоцитов или PCAM1, также известную как CD31, в качестве маркера для маркировки кровеносных сосудов, было замечено, что все адипоциты находятся в контакте с капиллярами по всей ткани, поддерживая высокую потребность в эффективном обмене питательных веществ и кислорода при жировой ткани.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области жировой биологии для изучения дополнительных вопросов, таких как ранний морфогенез тканей и картирование судьбы предшественников адипоцитов. Он также может быть применен для изучения гистологии жировой ткани человека. Не забывайте, что работа с параформальдегидом, метанолом, дихлорметаном и дибензиловым эфиром может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование вытяжного шкафа и средств индивидуальной защиты.