Иммуногистохимическое определение 5-метилцитозин и 5-Гидроксиметилцитозин в развивающихся и Постмитотические мыши сетчатки

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области метилирования ДНК, такие как изменения хроматина во время развития сетчатки в постмитотической сетчатке. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она может быть надежно использована на любых срезах из всех тканей сетчатки мыши, несущих распределение 5-метилцитозина, 5-гидроксиметилцитозина, которые обрабатываются аналогичным образом. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы подготовки тканей и окрашивания трудно изучить, потому что при использовании замороженных гистологических препаратов ценная организационная и исходная ткань может быть потеряна.

Демонстрировать остальную часть процедуры будет Пабло Диас, научный сотрудник нашей лаборатории. Чтобы начать эту процедуру, используйте иглу 29 калибра в полдюйма, чтобы проколоть глаза обезглавленной усыпленной мыши на тыльной стороне глаз. Чтобы получить наглазники, немедленно сделайте энуклеацию глаз, разрезав вокруг склеры тонкими офтальмологическими ножницами, чтобы удалить роговицу и хрусталик.

Зафиксируйте наглазники и целые глаза E16 в 4% параформальдегиде или PFA в 1xPBS pH 8,0 на 20 минут при комнатной температуре. Постирайте их дважды в одном миллилитре 1xPBS при комнатной температуре в течение 10 минут. Для криозащиты наглазников и глаз целиком инкубируйте их при 1xPBS pH 8,0 с 10% сахарозой при комнатной температуре в течение одного часа.

Затем в 20%сахарозе в 1xPBS в течение одного часа. И, наконец, в 30% сахарозы в 1xPBS при 4 градусах Цельсия в течение ночи. На следующий день вставьте наглазники и глазки в смесь с оптимальной температурой резки (OCT) в криоформах.

Затем заморозьте их в ванне с сухим льдом и этанолом и держите при температуре 80 градусов по Цельсию. Перед началом криосекции извлеките формы со встроенными наглазниками и глазами при температуре 80 градусов Цельсия. Поместите их в держатель криостата и дайте им уравновеситься до 20 градусов Цельсия в течение одного часа.

С помощью криостата при температуре 20 градусов Цельсия разрежьте поперечные сечения сетчатки толщиной 12 микрометров параллельно височно-носовой оси через диск зрительного нерва. Закрепите срезы на предметных стеклах микроскопа и храните при температуре 80 градусов Цельсия. Чтобы начать иммуноокрашивание, используйте гидрофобную барьерную ручку, чтобы обвести участки сетчатки, установленные на предметных стеклах.

Промойте секции один раз 200 микролитрами 1xPBS в течение 10 минут. Промойте срезы 200 микролитрами PBST в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем денатурируйте их с помощью 200 микролитров свежеприготовленной тщательно титрованной 2 нормальной соляной кислоты в 1xPBS в течение 45 минут при 37 градусах Цельсия для оптимизации сигнала 5mC.

После денатурации добавьте 100 микролитров 0,1 Tris-HCl pH 8,3 на участки сетчатки, и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре для их нейтрализации. Затем добавьте 500 микролитров блокирующего раствора. И инкубируйте секции в камере влажности при комнатной температуре в течение одного часа.

Добавьте соответствующие антитела, разведенные один к 500 в блокирующем растворе, в срезы и инкубируйте в течение ночи при четырех градусах Цельсия. На следующий день промойте секции три раза по 10-15 минут каждый с 0,1% PBST. Добавьте соответствующие вторичные антитела, разведенные один к 1000 в блокирующем растворе, содержащем раствор DAPI, при комнатной температуре в течение одного часа.

Далее промойте предметные стекла три раза по одному миллилитру 0,1%-ного PBST в течение 10 минут каждый. После последней промывки добавьте водную монтажную среду. Накройте крышкой.

А затем приступают к конфокальной микроскопии. После иммуноокрашивания сетчатки на уровне E16 сигнал 5mC был сильным в хромоцентрах ядра клетки и присутствовал на гораздо более низком уровне во всех ядрах клеток. Окрашивание 5hmC было обнаружено исключительно в ядрах клеток и отсутствовало в хромоцентрах.

В сетчатке P0 сигналы 5mC и 5hmC присутствовали во внешнем и внутреннем слоях нейробластов. Сигнал 5mC был сильным в хромоцентрах и на периферии ядер клеточных ядер и слабее между хромоцентрами клеточных ядер. Окрашивание 5hmC было ограничено ядром клетки.

В сетчатке P15, во внешнем ядерном слое, сигнал 5mC был обнаружен в хромоцентрах ядра клетки и на периферии ядра. В то время как сигнал 5hmC был во всех ядрах клетки, за исключением хромоцентров. Во внутреннем ядерном слое и слое ганглиозных клеток сигнал 5mC был сильным в хромоцентрах клеточных ядер и слабым во всех клеточных ядрах.

В то время как сигнал 5hmC был обнаружен во всех ядрах клеток, за исключением хромоцентров. В фоторецепторах взрослых палочек сигнал 5mC был ограничен хромоцентром и ядерной периферией, в то время как сигнал 5hmC был ограничен ядерной периферией. При попытке этой процедуры важно помнить о том, что гистологические срезы обрабатываются с оптимальной экспозицией HCl, которая составляет 30 минут.

Если экспозиция меньше или больше, то оптимальные результаты не могут быть воспроизведены. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как жидкостная хроматография высокого давления, масс-спектрометрия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как количественная оценка изменений при измерении 5-метилцитозина и 5-гидроксиметилцитозина. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области развития нейронов к изучению эпигенетических изменений хроматина.

Не забывайте, что работа с HCl и PFA может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как правильная утилизация.