Изготовление приборов рефракционной соответствует индекс для биомедицинских микрофлюидика

Этот метод может помочь решить важную проблему в сочетании микроскопии с микрофлюидикой за счет обеспечения согласования показателя преломления между структурой микроканала и водными средами внутри канала. Основное преимущество этой технологии заключается в том, что она совместима с методами изготовления, обычно используемыми для создания микрофлюидных устройств. Еще одним ключевым преимуществом нашего подхода является метод герметизации микроканалов из материалов с низкой адгезией, что является распространенной проблемой среди полимеров с индексом преломления скважин

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как шаги по герметизации канала могут быть сложными для правильного выполнения. Например, важно, чтобы резервуары не были заблокированы во время зажима. Начните эту процедуру с получения полидиметилсилоксана, или PDMS, отрицательного, как описано в текстовом протоколе.

Затем заполните негатив PDMS 400 микролитрами MY-133-V-2000. Негатив нужно немного перелить. Поместите негатив PDMS с заполненным MY-133-V-2000 в вакуумную камеру на два часа, чтобы удалить любые пузырьки.

После извлечения MY-133-V-2000 из вакуумной камеры прижмите предметное стекло к верхней части слегка переполненного негатива, чтобы создать плоскую поверхность MY-133-V-2000 и предотвратить ингибирование полимеризации кислородом. Затем вставьте MY-133-V-2000 в 400-ваттную УФ-печь. Установите УФ-излучение на 50% от максимальной интенсивности на 300 секунд, чтобы отверждать микроканал.

Это мощность примерно 4,5 джоуля на квадратный сантиметр, что примерно в два раза превышает минимальную мощность отверждения, рекомендованную производителем. После резки акрила, как описано в текстовом протоколе, нанесите две небольшие капли на край акрила, а затем используйте одноразовый инструмент, чтобы равномерно распределить клей. Поместите стеклянную подложку на акрил и дайте клею высохнуть, используя вес стекла для удержания его на месте.

Нанесите на открытое стекло 100 микролитров PDMS с помощью пипетки прямого действия. Затем вставьте базовый слой в вакуумную печь для нанесения покрытия, чтобы равномерно покрыть стекло пленкой PDMS толщиной примерно 10 микрометров со скоростью 1500 об/мин в течение двух минут. Снимите базовый слой с отвержной машины и тщательно сотрите излишки PDMS, которыми был покрыт акрил ацетоном и бумажным полотенцем.

Будьте осторожны, чтобы не потревожить невылеченный PDMS. Теперь запекайте базовый слой с помощью PDMS в духовке при температуре 65 градусов Цельсия в течение двух часов, чтобы PDMS затвердел. Нанесите один миллилитр PDMS на предметное стекло, а затем с помощью другого предметного стекла равномерно распределите PDMS, пока он не начнет сочиться по бокам.

Высушите его на горячей плите при температуре 150 градусов Цельсия в течение 10 минут. Разрежьте отвержденный PDMS на прямоугольник с теми же размерами, что и прибор MY-133-V-2000. Затем, используя средний слой акрила в качестве формы, пробиваем отверстия для резервуара и вырезаем квадратное смотровое окно в PDMS, чтобы сделать прокладку PDMS.

Теперь извлеките отвержденный MY-133-V-2000 из УФ-печи, снимите канал с негатива и поместите его на плоскую подложку стороной канала вверх. Снимите базовый слой, содержащий отвержденный PDMS, из духовки при температуре 65 градусов и поместите его на подложку. Затем поместите подложку с каналом MY-133-V-2000 и базовым слоем в кислородный плазменный очиститель.

Установите давление вакуума на 200 миллиторр и уровень радиочастоты на высокий. Приступайте к обработке поверхности канала и стеклянной подложки в течение 30 секунд. Кислородная плазма должна светиться синим цветом при включении плазменного очистителя

Через 30 секунд снимите микроканал и базовый слой с очистителя плазмы. С помощью щипцов немедленно поместите канал MY-133-V-2000 вниз в прямоугольный вырез из акрила базового слоя так, чтобы он соприкасался с PDMS. Теперь поместите прокладку PDMS на верхнюю часть устройства MY-133-V-2000, совместив отверстия в прокладке с резервуарами в устройстве.

Использование этой прокладки PDMS имеет решающее значение, потому что PDMS более эластична, чем MY-133-V-2000, и поэтому может быть более сжата. Это позволяет передавать усилие от акрила к микроканалу, не разбивая стекло. На этом этапе поместите незаконченное устройство на приподнятую платформу над скамейкой, чтобы обеспечить зажимную поверхность для сборки устройства.

Затем извлеките три миллилитра акрилового цемента с помощью шприца. Распределите достаточное количество акрилового цемента поверх базового слоя, чтобы обеспечить тонкое покрытие. Сделайте слой максимально ровным и не допускайте просачивания материала в канал.

Теперь поместите акриловый кусок среднего слоя поверх базового акрилового слоя. Следите за тем, чтобы отверстия совпадали с резервуарами канала MY-133-V-2000. Прижмите средний слой к базовому слою как можно плотнее и удерживайте его в течение двух минут, пока цемент не затвердеет, чтобы соединить кусочки акрила вместе.

Убедитесь, что резервуары не засорены во время этого этапа, чтобы предотвратить попадание воздуха под устройство MY-133-V-2000. Воздух, попавший между MY-133-V-2000 и субстратом, останется в ловушке, если резервуары заблокированы. Это приведет к утечкам в готовом устройстве.

Поэтому очень важно, чтобы отверстия не были заблокированы на этом этапе. После того как цемент застынет, снимите давление с устройства. Поместите акриловый цемент на средний слой в местах предполагаемого контакта с верхним слоем акрила.

Теперь поместите верхний слой акрила на средний слой акрила, убедившись, что отверстия совпадают с резервуарами. Дайте ему постоять на скамейке две минуты, пока акриловый цемент высохнет. Протестируйте прибор MY-133-V-2000, добавив 10 микролитров пищевого красителя или деионизированной воды в одно из отверстий резервуара для проверки адгезии и текучести.

Вставьте трубку в противоположный резервуар и подключите другой конец к вакуумной ловушке. Включите пылесос, чтобы протянуть краситель или воду через канал, чтобы убедиться, что устройство было создано успешно. Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться в отсутствии утечек в канале или резервуаре.

С помощью вакуума удалите краситель из обоих резервуаров. Затем промойте резервуары этанолом. Поместите этанол в один резервуар.

Протяните этанол с помощью пылесоса. Дайте этанолу постоять при комнатной температуре в течение 10 минут. Тщательно сбрызните канал этанолом и положите его в стерильную посуду из полистирола.

Плотно оберните его парапленкой и храните до тех пор, пока не понадобится. Показанная здесь тепловая карта представляет собой массу адгезивных клеток MCF-7 FOD в микроканале. У стен микроканала видно несколько артефактов.

При этом измерении на краю микроканала рядом со стеной можно увидеть одну адерентную ячейку MCF-7. Отсутствие артефактов вблизи стенки позволяет получать точные количественные измерения, даже когда клетки находятся в непосредственной близости от стенки канала. На этом последнем рисунке показана пара ячеек MCF-7, расположенных рядом со стенкой микроканала.

Масса этих клеток на каждом пикселе может быть точно измерена с помощью количественной фазовой микроскопии. Следуя этому протоколу, важно не засорять резервуары при зажиме устройства, пока акриловый цемент высыхает. Засорение отверстий задерживает воздух между MY-133-V-2000 и подложкой.

Это приведет к утечкам в канале во время течения. Использование MY-133-V-2000 в качестве материала для изготовления микрофлюидных устройств обеспечивает явное преимущество по сравнению с традиционными материалами за счет значительного уменьшения артефактов вблизи стенок микроканалов. Это позволяет проводить количественные измерения в непосредственной близости от микроканальных структур.

Устройства, изготовленные по этому протоколу, совместимы с любым широко используемым методом микроскопии. Этот протокол основан на клеточной патологии, поэтому он совместим с другими передовыми микрофлюидными методами, такими как сортировщики клеток или градиентные генераторы для изучения поведения клеток. В целом, этот метод вооружает исследователей новым инструментом для биомедицинских микрофлюидных анализов на основе микроскопии.

Дополнительная точность, которую он обеспечивает для количественных измерений в микроканалах, имеет важное применение во многих областях, включая разработку лекарств и анализ одиночных клеток.