Изоляция первичного мыши гепатоцитов для зарождающейся белка синтез анализа методом маркировки нерадиоактивные L-azidohomoalanine

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в различных областях исследования метаболических заболеваний о молекулярных изменениях печеночной энергии и биосинтеза белка при ожирении, безалкогольной жировой печени и диабете второго типа. Основными преимуществами этого метода являются то, что он облегчает изоляцию функциональных первичных гепатоцитов мыши и обнаружение печеночными зарождающимися белками с помощью нерадиоактивного маркировки субстрата. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, как шаг перфузии трудно узнать из-за малых и тонких кровеносных сосудов мыши.

Для перфузии печени, тщательно вставьте 24 калибровочный катетер в Нижняя Vena Cava или IVC только при бифуркации с правой почечной вены. Удалите катетерную иглу, поддерживая положение канюли в IVC, и соедините 24-калиберную канюлю с перфузиольной трубкой с помощью разъема. Начните perfusing печени с теплым HBSS минус на четыре миллилитров постоянной скорости потока быстро резки splenic вены для слива внутренней крови.

Через 10 минут, perfuse мыши печени с 35 миллилитров HBSS плюс дополняется Collagenase Тип X со скоростью потока четыре миллилитров в минуту, зажимая splenic вены в течение примерно 10 секунд каждые несколько минут, чтобы облегчить распределение перфуза по всей печени. Когда все коллагеназы была пролита, передать печень на лабораторные ткани перед остановкой насоса, чтобы избежать обратного потока крови в печень. Используйте типсы, чтобы удалить желчный пузырь и аккуратно протрите печень свежей лабораторной тканью, чтобы удалить кровь.

Поместите печень в 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую пять миллилитров свежего теплого HBSS плюс дополненный коллагеназы и использовать бродячих наконечником типса, чтобы аккуратно удалить капсулу печени. Используйте щипцы, чтобы тщательно разогнать паренхимальной ткани и добавить 15 миллилитров холодной DMEM в чашку Петри. Встряхните разорванную печень осторожно, чтобы освободить остаточные паренхимальные клетки в среду и добавить еще 15 миллилитров холодного DMEM к блюду, чтобы приобрести остальные клетки.

Затем фильтруй навоз ткани через 100 микрон-клеточный ситечко в 50 миллилитровую коническую трубку на льду. Чтобы изолировать первичные гепатоциты мыши, соберите клетки путем центрифугации и повторно посовеще гранулы в 10 миллилитров свежего DMEM. Тщательно слой клетки над 40%density градиент буфер для разделения градиента плотности, отбрасывая клетки из верхнего и среднего слоев после центрифугации.

Resuspend первичной паренхимальной гранулы гепатоцитов с двух до трех миллилитров Среднего E Уильяма, чтобы избежать сбора мертвых клеток от стенки трубки и передачи клеток в новую 50 миллилитровую трубку. Смешайте клетки с дополнительными 7 до 8 миллилитров Уильяма E Medium до центрифугации и повторно гранулы в 10, 20, или 30 миллилитров свежих Средний E Уильяма в зависимости от размера гранулы. После подсчета, семена шесть раз от 10 до пятой клетки к каждому хорошо из шести хорошо пластины для двух-трехчасовой инкубации при 37 градусов по Цельсию.

В конце инкубации замените среду DMEM, дополненную 10%Fetal Bovine Serum и анти-анти, чтобы удалить мертвые и незакрепленные клетки и вернуть клетки в инкубатор на ночь. Для азед-модифицированной зарождающейся маркировки белка добавьте от 20 до 40 микрограммов клеточного лизата до 50 микролитров буфера реакции 2X. Довнесите объем до 80 микролитров с дистиллированной деионизированной водой и вихрем белкового раствора в течение пяти секунд.

Добавьте пять микролитров сульфата меди в клетки для другого пятисекторного вихря, а затем пять микролитров реакционной буферной добавки один с пятью секундами вихря. После трехминутной инкубации добавьте 10 микролитров восстановленной реакционной буферной добавки два к клеткам для другого пятисекторного вихря и поверните образец в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия на многогниторной машине, защищенной от света. В конце вращения добавьте в лизат 300 микролитров метанола, за которыми последуют 75 микролитров хлороформа и 200 микролитров двойной дистиллированной воды.

Соберите помеченный белок центрифугой и добавьте в гранулы 250 микролитров свежего метанола. После вихря, центрифуга лисат снова и покрыть голые гранулы с ворс свободной ткани в течение 15 минут при комнатной температуре. Для анализа PAGE, solubilize сушеные гранулы в 20 микролитров загрузки буфера без бета-меркаптоэтанола и вихрь гранулы в течение 10 минут.

Затем нагрейте белок в тепловом блоке 70 градусов по Цельсию в течение 10 минут и загрузите образец на 10% сульфатный гель додедил сульфата натрия для обнаружения теттраметилродамина. Затем используйте лазерный сканер переменного режима для точной количественной оценки зарождающихся белков, помеченных AHA. Гистологически, живые и прикрепленные первичные гепатоциты кажутся типично многоугольными или шестиугольными по форме с четко изложенной мембранной границей после 24 часов культуры.

Чтобы подтвердить, являются ли изолированные клетки первичными гепатоцитами, в этом эксперименте уровни экспрессии белка альбумин были сравнены в эмбриональных фибробластах мыши, линии клеток гепатомы мыши, изолированных первичных гепатоцитах мыши и печени мыши. Выражение белка альбумин было обнаружено в первичных гепатоцитах мыши и печени мыши, но не было обнаружено ни в эмбриональных фибробластах мыши, ни в клетках линии гепатомы. Первичное лечение гепатоцитов с помощью 10 микромоляных ротенонов в течение четырех-шести часов выявило надежную индукцию печеночным киназы с активацией АМП, как это было обнаружено повышенным уровнем фосфорилирования на печеночным киназе T172, активированном AMP, аналогичном наблюдаемому in vivo.

Действительно, пять часов из 10 микромоляных ротенон лечение было глубокое ингибирующее воздействие на зарождающийся синтез белка в обработанных первичных гепатоцитов по сравнению с необработанных контрольных клеток, как попродемонстрировано химиоселективной перевязки реакции анализа. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы подготовить все необходимые реагенты и среды заранее. Этот метод проложил путь для исследователя в области печеночной метаболической патофизиологии, чтобы исследовать молекулярный механизм регуляции энергетического белка при ожирении и диабете второго типа в изолированных первичных гепатоцитах мыши.