Изготовление анизотропной полимерного искусственного антиген представляющих клеток для CD8 + Т-клеток активации

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области аминокислот. Например, какова роль физических свойств частиц в взаимодействии и активации биоматериалов иммунных клеток. Основным преимуществом этой техники является то, что она позволяет самостоятельно контролировать размер и форму биомиметических частиц.

Последствия этого метода распространяются на терапию рака, как это с полки частицы терапии, которые могут вызвать in vivo клеток опосредовано иммунных реакций. Хотя этот метод может дать представление о раке аминокислоты, он также может быть применен к другим системам. Например, инфекционное заболевание или диабет 1-го типа.

Для синтеза микрочастиц, начните с взвешивания 100 миллиграммов поли (молочно-когликолевая кислота) или PLGA, в сцинтилляционный флакон и растворения PLGA в пяти миллилитров дихлорметана вихрем. Поместите гомогенизатор в стакан, содержащий 50 миллилитров 1%поливиниловый спирт, или PVA раствор, так что гомогенизатор как можно ближе к нижней части стакана, как это возможно, не касаясь его. Включите гомогенизатор до соответствующей скорости и добавьте решение PLGA в стакан в течение одной минуты гомогенизации.

В конце гомогенизации, залить поливиниловый спирт PLGA микрочастицы раствор в стакан, содержащий 100 миллилитров 5%PVA раствор на пластине перемешать в химическом капюшоне и перемешать раствор, по крайней мере четыре часа. Когда растворитель испарится, вылейте раствор частицы в 50 миллилитровых конических трубок и собирать частицы центрифугации. Замените супернатант в каждой трубке на 20 миллилитров деионизированной воды и повторно приостановив частицы вихрем.

Затем довести окончательный объем в каждой трубке до 50 миллилитров со свежей деионизированной водой и мыть частицы еще в два раза, как только что продемонстрировали. Для синтеза наночастиц растворите 200 миллиграммов PLGA в пяти миллилитров дихлорметана и поместите зонд sonicator в стакан, содержащий 50 миллилитров раствора 1%PVA на льду, не касаясь дна стакана. Начните sonication на 12 ватт и немедленно добавьте разрешение PLGA к стакану на 2 минуты sonication для того чтобы произвести nano-частицы с приблизительно диаметром 200 nanometer.

После sonication, залить 1%поливиниловый спирт PLGA наночастицы раствора в стакан, содержащий 100 миллилитров 5 PVA раствора на пластине перемешивания в течение четырех часов растворителя испарения в химическом капюшоне дыма. Когда весь растворитель испаряется, залить раствор частиц в 50 миллилитров конических труб для центрифугации, чтобы удалить любые микрочастицы и удалить супернатанты. Затем перенесите наночастицы в высокоскоростные центрифуги трубы для трех моет в деионизированной воде, как попродемонстрировано.

Для изготовления полимерных частиц после последней стирки повторно приостанавливайте частицы примерно в миллилитр свежей деионизированной воды и добавляйте раствор литья пленки к частицам до конечной концентрации 2,5 миллиграмма на миллилитровые частицы. Перенесите суспензию частиц в 10 миллилитров алицитов в прямоугольные чашки Петри размером 75 на 50 миллиметров для одномерного растяжения. Или в 15 миллилитров aliquots в 100 на 100 миллиметров квадратных чашек Петри для двухмерного растяжения.

После ночной сушки в химическом капюшоне используйте пинцет, чтобы удалить пленки и обрезать края ножницами. Для 1D растяжения, место два коротких края одной пленки между двумя кусками неопреновой резины для монтажа на алюминиевые блоки одной оси автоматизированной тонкой пленки растяжения устройства. Затем используйте гаечный ключ Аллена, чтобы винт металлические ручки на верхней части резины, чтобы держать пленку на месте.

Для 2D растяжения, смонтировать все четыре края на четыре алюминиевых блоков, чтобы растянуть пленку на обоих осей измерения и записи длины пленки между алюминиевыми блоками на одной оси для одного D растяжения или обе оси для 2D растяжения и рассчитать расстояние, необходимое для растянуть пленку в одном или двух направлениях на основе желаемого раза стрейч. Затем поместите пленку загружен растяжения устройства в духовке при температуре 90 градусов по Цельсию рядом с большим стаканом небольшого количества воды, чтобы довести пленку до температуры в течение 10 минут. Когда растяжение завершено, дайте пленке остыть до комнатной температуры в течение 20 минут.

Для 1D растяжения, вырезать пленку из растяжения устройства по краям. Для 2D растяжения, вырезать и сохранить центральный квадрат пленки, которая равномерно растягивается на обеих осях. Поместите пленки в 50 миллилитровых конических трубок с не более чем двумя пленками на трубку и добавьте приблизительно 25 миллилитров деионизированной воды к каждой трубке для вихря.

Когда пленки растворились, мыть частицы три раза в деионизированной воде, как попродемонстрировано. Повторное приостановление частиц примерно в один миллилитр свежей деионизированной воды на трубку после последней стирки. Затем заморозить частицы при температуре минус 80 градусов по Цельсию в течение одного часа или на ночь лиофилизации.

На следующее утро повторно приостанавливаем лиофильные микро- или наночастицы на уровне 20 миллиграммов на миллилитр в свежеприготовленном буфере МЕ СВЕ с вихрем. Добавьте 100 микролитров раствора частиц в полипропиленовую микроцентрифугу, содержащую 900 микролитров буфера МЭС, и добавьте 100 микролитров свежеприготовленного раствора EDC NHS. Смешайте частицы вихрем и инкубировать частицы на инверторе при комнатной температуре в течение 30 минут.

В конце инкубации, собирать частицы центрифугации и повторно приостановить микрочастиц гранулы в один миллилитр PBS путем вихревого или повторно приостановить наночастицы в один миллилитр PBS на пять секунд sonication на два-три Вт. Далее добавьте восемь микрограммов подходящего сигнала один белок и 10 микрограммов антител антимышки CD28 к микрочастицам, или 16 микрограммов сигнала один белок и 20 микрограммов антимошейки CD28 к наночастицам. Довнесите окончательный объем в каждой трубке до 1,1 миллилитра с PBS и инкубировать частицы на ночь на инверторе при четырех градусах цельсия.

На следующий день, мыть частицы три раза в деионизированной воде, как попродемонстрировано. Эти PLGA nano и микрочастицы были синтезированы с использованием методов единой эмульсии, как попродемонстрировано и изображено с помощью передачи и сканирования электронной микроскопии. После гомогенизации микрочастицы продемонстрировали средний диаметр около трех микрометров.

Сферические микрочастицы имели рацион аспекта около одного, в то время как 1D растянутые эллипсоидные частицы имели большее соотношение аспектов приблизительно три с половиной, а 2D растянутые эллипсоидные частицы имели соотношение сторон около 1,2, примерно поддерживая соотношение сторон одного. Результаты конъюгации показывают аналогичное количество белка на поверхности сферических и эллипсоидных микро-искусственных антигенов, или AAPC и nano-AAPC, демонстрируя, что соединение белка во время синтеза AAPC происходит в зависимости от концентрации. Было установлено, что пролат эллипсоидный ААПЦ вызывает более высокие уровни пролиферации Т-клеток в субэсатурирующих дозах, чем сферический ААПЦ с лучшим разделением, достигнутым в дозе 01 миллиграмм.

После семи дней, ручной подсчет Т-клеток показали, что пролат эллипсоидных AAPC более эффективно стимулировать Т-клеток по сравнению с их сферическими коллегами на микро-и нано масштаба в дозе зависимым образом. После этой процедуры, AAPC может управляться in vivo, чтобы оценить их терапевтическую эффективность и фармакокинетику. После его развития, этот метод помог проложить путь для исследователей в области иммуно-инженерии, чтобы исследовать влияние анисотропии на эффективность ААПЦ.