Ex Vivo Визуализации ячейки конкретных кальция сигнализации на трехсторонней синапса диафрагмы мыши

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в нервно-мышечной области, такие как роль кальция сигнализации в мышцах или schwann клеток в ответ на стимуляцию нерва. Основным преимуществом этой техники является то, что можно изображение активации конкретных типов клеток в ответ на стимуляцию нервов. Для начала, получить трансгенных мышей, и генотип их, как описано в текстовом протоколе.

После эвтаназии, поперечно раздел по всему животному чуть ниже печени и чуть выше сердца и легких с ножницами иридэктомии. Рассекают печень, сердце и легкие. Быть осторожным, чтобы поддерживать длину френического нерва, который достаточно долго, чтобы быть втянутым в всасывающий электрод.

Далее удалите грудную клетку и позвоночник, за исключением тонкого хребта вокруг диафрагмы. Поместите диафрагму и образец френического нерва в микрофьюдж-трубку с раствором Кребс-Рингер, содержащим один микрограмм на миллилитр флуоресцентно помеченного альфа-бунгаротоксина. Разрешить образцу инкубировать в растворе в течение 10 минут в темноте.

Используя минутин булавки обездвижить диафрагму, прикрепив его на шесть сантиметров блюдо, покрытое силиконовым диэлектрическим гелем и заполнены примерно восемь миллилитров кислородом Krebs-Ringer раствора. Поместите блюдо на сцену микроскопа. Затем, perfuse диафрагмы с более Krebs-Ringer раствор на восемь миллилитров в минуту в течение 30 минут.

В четыре раза увеличение, с помощью микроманипулятора, переместить всасывающий электрод над левым френическим нервом. Нанесите всасывание, вытащив ствол пятими миллилитрового шприца, подключенного к трубе, которая крепится к всасывающему электроду. Убедитесь, что диафрагма контрактов в ответ на один герц стимуляции, визуально рассматривая его с Брайтфилд освещения.

Если нет, отрегулируйте напряжение, поворачивая ручку напряжения постепенно для достижения надмаксимального импульса, который может быть проверен визуальным исследованием сокращения мышц. Если все еще не видно, выдуть нерв шприцем и попытаться привлечь его снова, применяя всасывания. Теперь выключите перфузию, чтобы добавить мышцы конкретных ингибитор миозин BHC или напряжение закрытого канала натрия антагонист му-конотоксин.

Подготовка BHC предварительного разбавления путем трубопроводов четыре микролитров 200 миллимолярный запас BHC в DMSO в один миллилитр Кребс-Рингер раствор. Удалите из блюда один миллилитр раствора Кребс-Рингер. Затем добавьте предварительно разбавленный БХК в блюдо.

Через 30 минут включите перфузию свежего раствора Кребс-Рингер еще на 20-30 минут. Надев перчатки, подготовьте записывающий электрод, поместив борозиликатное нитематическое стекло с внешним диаметром в один миллиметр и внутренним диаметром 0,4 миллиметра в шкив микропайпта. Затяните циферблаты, чтобы зажать его в положение и закрыть дверь шкив.

Затем запрограммировать шкив, как описано в текстовом протоколе. Для эмбриональных диафрагм, измерить сопротивление с помощью программного обеспечения управления усилителем. Убедитесь, что сопротивление составляет около 60 мегаохм и для старых диафрагм, от 10 до 20 мегаохм.

Теперь загрузите записывающий электрод тремя хлоридом толярного калия. При 10-м увеличении опустите электрод в мышцу, используя второй микроманипулятор на противоположной стороне сцены в качестве стимулирующего электрода. Использование электрофизиологического программного обеспечения для получения данных ждать, пока потенциал отдыха мембраны меняется от нуля до минус 65 милливольт или ниже.

Стимулировать на одном герц и проверить наличие мышечного потенциала действий, проверяя на большой потенциал, который демонстрирует скромный превышение. Не путайте артефакт стимуляции с потенциалом действия. В 20 раз увеличение найти конец полосы пластины в центре мышцы, глядя на флуоресцентно помечены альфа bungarotoxin нервно-мышечных соединений под зеленым желтым светом возбуждения.

Переключитесь на возбуждение синего света для изображения реакций кальция в мышечных, моторных нейронах или клетках Шванн. В этом примере GCaMP три выражается в мышечных клетках. При желании на настройку сплиттера изображения с помощью фильтров для прохода полосы и дихроического фильтра с одним краем для изображения двойной длины волны.

Выполните эксперименты с яркостью бар на столе lookup набор до 110% от уровня, на котором генетически закодированный индикатор кальция, выражаюющий ткани экспонатов насыщения в 20 раз увеличение без binning в ответ на хлорид калия. Запись на 20 кадров в секунду, чтобы не пропустить каких-либо быстрых событий. Стимулировать с 1 до 45 секунд от 20 до 40 герц стимуляции нерва путем доставки поезд импульсов с помощью всасывающего электрода и собирать динамические флуоресцентные реакции кальция в одной клетке подтипа вместе со статической флуоресцентно помечены альфа bungarotoxin нервно-мышечного сигнала соединения.

Фармакологические агонисты также могут быть добавлены путем применения ванны или перфузии и динамические реакции флуоресцентного кальция могут быть собраны таким же образом. Когда визуализация или электрофизиологические эксперименты закончены, потому что желаемые результаты были достигнуты, пронизывать воду через линии перфузии и сосать воду два-три раза через всасывающий электрод, чтобы гарантировать, что соли не строятся. Пространственная карта реакции кальция клетки Schwann к phrenic стимуляции нерва Wnt одного GCaMP 3 диафрагмы мыши на столбе натальном дне 7 показывает ограничение к клеткам schwann терминального парасинаптика на нервном мышечном соединении.

Та же диафрагма была изображена после маркировки флуоресцентно помечены альфа-бунгаротоксин, который связывает, чтобы ацетилхолиновые рецепторы нервно-мышечного соединения. Та же диафрагма была также изображена под освещением Брайтфилда, чтобы направлять записывающий электрод к постсинаптической области мышцы нервно-мышечным соединением. Здесь показана пространственная демаркация цветных клеток или областей, представляющих интерес для анализа отдельных переходных кальциев.

Пространственная карта реакции кальция мышечных клеток mth 5 GCaMP трех mouse diaphragm на P 4 к френической стимуляции нерва в присутствии ингибитора миозин BHC показывает реакцию повсеместно в весь регион всех клеток мышц диафрагмы. В отличие от этого, стимуляция той же диафрагмы в присутствии му-конотоксина вызывает пространственно ограниченный ответ кальция в медиальной области всех клеток мышц диафрагмы, что соответствует кластеру рецепторов ацетилхолина обогащенной конечной полосы пластины. После этой процедуры другие методы, такие как иммуно-гистохимия или иммуноблоттинг могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как, что молекулярный профиль клеток, выявленных электрофизиологии или кальция изображений?

Этот метод может обеспечить понимание реакции населения клеток Шванн и мышечных клеток на стимуляцию нервов у нормальных неонатальных мышей. Он также может быть применен к изучению старых мышей или к изучению мышей, выражаюющих нервно-мышечные заболевания, связанные с белками.