Анализ тилакоидной мембраны белковых комплексов, синий родной гель-электрофорез
28 сентября 2018 г.
Протокол для освещения растений тилакоидных белков сложной организацией и композиция с голубой родной полиакриламида гель электрофореза (БН-страница) и описал 2D-SDS-PAGE. Протокол оптимизирован для Arabidopsis thaliana, , но может быть использован для других видов растений с незначительными изменениями.
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о составе и динамической организации фотосинтетических белковых комплексов в растительной тилакоидной мембране. Основным преимуществом этой методики является то, что она позволяет проводить анализ функциональных взаимодействий между отечественными белковыми комплексами и проясняет пластичность организации белкового комплекса в различных условиях окружающей среды. Настройка гель-кастера на 8-сантиметровые на 10-сантиметровые пластины в соответствии с инструкциями производителя с использованием 0,75-миллиметровых промецев.
Поместите градиентный миксер на тарелку для перемешивания и соедините его с перистальным насосом путем трубки. Прикрепите шприц-иглу к другому концу трубки и поместите иглу между стеклянной и алюминиевой пластиной. Поместите магнитный мешалка в тяжелую камеру.
Подготовка 3,5% и 12,5%acrylamide решений в 15-миллилитровых конических центрифуг труб, как подробно описано в текстовом протоколе для использования для разделения гель градиента. Для предотвращения несвоевременной полимеризации держите центрифуговые трубки на льду при подготовке растворов. Добавить 5%APS и TEMED прямо перед pippetting решения градиента смесителя.
Пипетт 12,5%решения для тяжелой камеры. Удалите пузырьки воздуха из канала, соединяющего свет и тяжелую камеру, открыв клапан, соединяющий две камеры, позволяя раствору войти в световую камеру. Закройте клапан и пипетки следы раствора обратно в тяжелую камеру.
Наконец, пипетка 3,5% раствор для световой камеры. Включите магнитный мешалка. Откройте клапаны и включите перистальтический насос.
Разрешить гель решения течь между стеклом и алюминиевой пластины со скоростью потока примерно 0,5 миллилитров в минуту. Игла должна быть выше жидкости во все времена. Когда тяжелые и легкие камеры опустели заполнить их с ультрачистой водой.
И дайте воде аккуратно наложить гель поверхности. Полимеризация геля занимает около одного-двух часов при комнатной температуре. Приготовьте раствор 3%acrylamide для укладки геля при комнатной температуре.
Pipette укладки гель на вершине полимеризованного геля разделения и место образца гель гребень между стеклом и алюминиевой пластины избегая пузырьков воздуха. После того, как гель будет полимеризуться в течение 30-60 минут при комнатной температуре, аккуратно удалите гребень под ультрачистой водой. На данный момент гель может храниться при положительных четырех градусах по Цельсию во влажных условиях в течение нескольких дней.
Разбавить изолированные тилакоиды с ледяным буфером 25BTH20G до окончательной концентрации хлорофилла в один миллиграмм на миллилитр. Подготовь две трубки для каждого образца тилакоида для выполнения как бета-DM, так и оцифровки дигитонина. Теперь добавьте равный объем буфера моющих средств.
Смешайте моющее средство и тилакоид образец осторожно с пипеткой и избежать принятия пузырьков воздуха. Solubilize thylakoids в течение двух минут на льду для бета-DM solubilization. Или 10 минут при комнатной температуре с непрерывным нежным смешиванием на рокере или шейкере для оцифровки солонина.
После инкубации, удалить стелькубилизированный материал центрифугации при 18000 г в течение 20 минут при положительном четыре градуса по Цельсию. Перенесите супернатант в новую 1,5-миллилитровую трубку и добавьте в образец 1/10 тома блестящего синего буфера Coomassie. Настройка геля в вертикальной системе электрофореза.
Заполните верхнюю буферную камеру синим катодным буфером и вылейте анодный буфер в нижнюю буферную камеру. Загрузите образцы тилакоидов в скважины. Запустите электрофорез и постепенно увеличивайте напряжение, как у перечислено в текстовом протоколе.
Вы запустите гель при положительных четырех градусах по Цельсию либо с помощью холодного помещения, либо с поправкой на температуру геля с помощью системы охлаждения. Измените синий катодный буфер на четкий катодный буфер, когда передняя часть выборки мигрировала около 1/3 геля. После электрофоретической пробежки сканируйте гель с помощью фотосканер для архивирования изображений.
Для выполнения 2-SDS PAGE соберите вертикальную электрофорезную систему с использованием одномиллиметровых промецев. Подготовь стандартный гель SDS с 2-D гребнем, как описано в текстовом протоколе. Вырежьте полосу от геля BN и поместите его в пятими миллилитровую трубку.
Затем добавьте два миллилитров буфера Laemmli и инкубировать полосу в течение 45 минут с нежной тряской при комнатной температуре. Поместите полосу с помощью спейсера поверх геля, избегая пузырьков воздуха. Pipette пять микролитров молекулярного маркера веса на узком куске фильтровальной бумаги и поместите бумагу в стандартный колодец.
Чтобы запечатать полосу геля BN и маркерную бумагу, залить 0,5%agarose в бегущем буфере поверх полосы геля и дать ему затвердеть. Выполняем электрофорез в соответствии со стандартными протоколами. После электрофоретической перспективе визуализировать белки с SUPRO Ruby пятно или окрашивание серебра.
Здесь показаны репрезентативные результаты тилакоидных белковых сложных моделей бета-ДМ и дигитонин-solubilized образцов. Небольшие комплексы мигрируют быстрее во время электрофоретической пробежки и поэтому находятся в нижней части геля. В то время как большие комплексы находятся в верхней части геля.
Дигитонин обычно сохраняет белковые комплексы в больших сборках, в то время как бета-ДМ мешает половых белково-белковых взаимодействий между комплексами. Здесь представлены подразрядный состав белковых комплексов бета-ДМ и дигитонин-solubilized тилакоидов. Подразделения каждого комплекса находятся от вертикальной линии ниже выровненного комплекса.
В принципе, каждое пятно в 2-D геле представляет собой индивидуальный белок. Но на практике в одном месте может присутствовать несколько белков одинаковой молекулярной массы. Идентификация пятен основана на анализе масс-спектрометрии.
После применения этой процедуры можно продолжить с другими методами, как электронная микроскопия и анализ отдельных частиц белковых комплексов eluted из синего родного геля, с тем чтобы получить структурное понимание белковых комплексов. Для выявления неизвестных белковых субъединых отдельных белковых пятен из двумерных SDS PAGE можно проанализировать с помощью масс-спецификации. Не забывайте, что работа с акриламидом и дигитонином может быть чрезвычайно вредной и такие меры предосторожности, как ношение защитных перчаток, всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается протокол анализа организации и состава белковых комплексов тилакоидов растений с использованием голубого нативного электрофореза в полиакриламидном геле (BN-PAGE) и двумерного электрофореза в ПААГ с SDS (2D-SDS-PAGE). Несмотря на то, что метод оптимизирован для Arabidopsis thaliana, его можно адаптировать и для других видов растений.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология растений
- Фотосинтез
- Анализ белковых комплексов
Теоретические сведения
- Понимание состава фотосинтетических белковых комплексов имеет решающее значение для биологии растений.
- Тилакоидные мембраны играют ключевую роль в фотосинтезе.
- Организация белковых комплексов может изменяться в зависимости от различных условий окружающей среды.
- Метод BN-PAGE позволяет проводить анализ нативных белковых комплексов.
Цель исследования
- Выяснить организацию и состав белковых комплексов тилакоидов.
- Исследовать функциональные взаимодействия между белковыми комплексами.
- Оценить пластичность организации белковых комплексов.
Используемые методы
- Голубой нативный полиакриламидный гель-электрофорез (BN-PAGE)
- Двумерный SDS-PAGE (2D-SDS-PAGE)
- Установка градиентного смесителя для приготовления геля
- Использование перистальтического насоса и магнитной мешалки для отливки геля
Основные результаты
- Данный протокол позволяет успешно определить состав белковых комплексов тилакоидов.
- Возможно проведение анализа функциональных взаимодействий между нативными белковыми комплексами.
- Можно оценить динамическую организацию белковых комплексов при различных условиях.
- Подтверждена адаптивность метода для различных видов растений.
Выводы
- Данный метод позволяет получить представление об организации фотосинтетических белковых комплексов.
- Он расширяет понимание адаптивности растительных белков к изменениям окружающей среды.
- Данный протокол может стать ценным инструментом для исследователей, изучающих биологию растений.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Понимание состава и динамической организации фотосинтетических белковых комплексов дает механистическое представление о путях преобразования энергии, что имеет важное значение для разработки продуктов на биологической основе. Метод Blue native PAGE позволяет проводить анализ функциональных взаимодействий нативных мультибелковых ансамблей, обеспечивая валидацию мишеней в фотосинтетических системах. Данный метод способствует снижению рисков при проверке гипотез на ранних стадиях за счет уточнения стабильности комплексов и их взаимодействий при различных условиях окружающей среды.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы путем определения состава нативных белковых комплексов и организации их субъединиц в тилакоидных мембранах.
- Операционная ценность: Обеспечивает снижение биологических рисков за счет прямой визуализации пластичности и стабильности комплексов в контролируемых условиях солюбилизации.
- Прогностическая ценность: Способствует приоритизации портфеля за счет разграничения стабильных и лабильных белок-белковых взаимодействий при использовании детергентов digitonin и beta-DM.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: обеспечивает подготовку солюбилизированных тилакоидных комплексов для последующего анализа с помощью стандартизированного разделения методом BN-PAGE с воспроизводимыми профилями миграции.
- Количественный результат: позволяет получить четкие профили комплексов, что дает возможность сравнивать состояния сборки при различных экспериментальных условиях.
- Повторное использование платформы: облегчает последующее проведение 2D-SDS-PAGE для идентификации субъединиц, расширяя возможности метода за пределы первичного профилирования комплексов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: связывает организацию комплексов на этапе открытия с функциональным выходом фотосинтеза при воздействии различных стрессовых факторов окружающей среды.
- Механистическое снижение рисков: разъясняет, как возмущения окружающей среды влияют на сборку суперкомплексов, что позволяет создавать прогностические модели устойчивости путей.
- Сопоставление биомаркеров: позволяет осуществлять мониторинг диссоциации или повторной сборки комплексов в качестве потенциальных индикаторов эффективности фотосинтеза.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод подходит для рабочих процессов на ранних этапах исследований, где требуется сохранение целостности нативного комплекса перед проведением редукционистского анализа, что позволяет перейти от выделения органелл к функциональному исследованию и последующему структурному анализу.
- Фундаментальная биология: позволяет проверить гипотезы о целостности цепи переноса электронов при фотосинтезе путем выделения комплексов PSII, PSI, Cyt b6f и АТФазы в нативном состоянии.
- Скрининг: обеспечивает получение профилей комплексов, готовых к анализу, с количественным разрешением полос для сравнительного изучения эффектов солюбилизации детергентами.
- Аналитика: позволяет получать данные на основе миграции, что дает возможность сравнивать стабильность и содержание комплексов при различных условиях.
- Трансляционные исследования: связывают организацию комплексов с функцией фотосинтеза, создавая связь с фенотипическими результатами в условиях стресса.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу для профилирования мембранных белковых комплексов в растительных системах, адаптируемую для других видов путем корректировки протокола.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает прогностическую уверенность в валидации мишени за счет сохранения нативных взаимодействий и выяснения сложной динамики.
- Операционная ценность: гарантирует стандартизацию за счет отливки градиентных гелей и воспроизводимого электрофоретического разделения при контролируемой температуре.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) за счет снижения механистической неопределенности при инженерии путей фотосинтеза.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию мишеней с учетом рисков на основе профилей стабильности и сложных взаимодействий.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области солюбилизации мембранных белков и методах нативного электрофореза.
- Необходимость использования миксера для создания градиента, перистальтического насоса и систем вертикального электрофореза с контролем температуры.
- Требуется стандартизация протоколов солюбилизации детергентами (beta-DM или дигитонин) для обеспечения воспроизводимого сохранения комплексов.
- Необходимость учета особенностей адаптации для различных видов растений в связи с различиями в составе тилакоидных мембран.
- Существуют практические ограничения, такие как разрушение лабильных комплексов под воздействием beta-DM и необходимость использования холодильной комнаты или совместимых систем охлаждения во время электрофореза.
