Идентификация, Гистологическая характеристика и рассечение мыши простаты лопастями для в Vitro 3D сфероида культура модели

Этот метод может помочь в начале генетически модифицированных моделей мыши рака простаты и исследования механизма рака простаты через in vivo и in vitro анализ. Основным преимуществом этой техники является то, что она позволяет провести полный анализ модели мыши рака предстательной железы, на всем пути от вскрытия тканей до изоляции клеток и культивирования. После разоблачения урогенитальной системы, или UGS, твердо схватить мочевого пузыря со средним тупым типсом, и поднять всю систему из брюшной полости мыши.

Сдвиньте ножницы под мочевым пузырем и простаты в всю дорогу до позвоночника, чтобы сделать разрез через спинной мозг, и прорезать все оставшиеся соединения с брюшной полости, чтобы удалить весь UGS. Перенесите UGS в шестисемейметровую чашку Петри, содержащую от двух до шести миллилитров PBS под рассеченным микроскопом. И использовать пару тонких тибры и ножницы микроперепись, чтобы тщательно очистить все жир от спинной и брюшной стороны ткани системы без snipping любой ткани простаты.

Когда весь жир был удален, потяните мочевой пузырь с типсами и акциз мочевого пузыря у его основания. Поместите оставшуюся вентраловую сторону ткани вверх и удерживая один проток концами с типсами, следуйте за сосудом к его основанию с ножницами и подакцизовать сосуд у его основания. Удалите тот же сосуд на другой стороне и вставьте типсы между семенными пузырьками и простаты, чтобы позволить snipping любой прилегающей соединительной ткани по мере необходимости.

Затем проследите семенные пузырьки к их основанию на уретре и удалите сосуды, не прокалыв их. Когда оба vesicles были удалены, место ткани спинной стороне так спинной доли, которые напоминают крылья бабочки видны. Держа каждую спинную долей типсами, разрезайте ткань у ее основания ножницами, чтобы собрать спинные доли и повернуть ткань на вентальную сторону.

Соберите боковые доли, которые являются небольшими и, как правило, обернуть уретру на стороне и вклинивается между передней, брюшной и спинной доли таким же образом. Соберите желудочковые доли, которые больше, чем боковой доли и лежат на уретры брюшной. Затем вырезать и отказаться от уретры для сбора передних долей.

Для обработки ткани простаты для 3D культуры, передать доли в 10-сантиметровое блюдо, содержащее два-три миллилитров DMEM, и использовать скальпель, чтобы фарш трубок простаты как можно тоньше и равномерно, как это возможно. Перенесите фрагменты тканей в стерильный капюшон культуры тканей и добавьте раствор ткани в новую 15-миллилитровую трубку. Доведите объем в трубке до девяти миллилитров со свежей средой и добавьте один миллилитр раствора бульона TenX коллагеназы в тканевую смесь.

После вихря, инкубировать трубку с встряхивания в течение двух часов при 37 градусов по Цельсию, чтобы ухудшить внеклеточной матрицы. В конце инкубации, собирать ткани центрифугации и повторно приостановить гранулы в два миллилитра теплых 05%полос в EDTA. После пяти минут 37 градусов по Цельсию, чтобы облегчить расщелину от клетки к клетке и клетки к матрице спайки, использовать P1000 трубы с широким кончиком доски, чтобы тритурировать ткани восемь-десять раз, чтобы разбить любые сгустки.

Повторите диссоциацию кончиком трубы P200. Затем нейтрализовать трипсин с тремя миллилитров полной среды. Смешайте 500 единиц DNASE1 в навоз ткани и передать раствор пять-десять раз через пять миллилитров шприц оснащен 18-го калибра иглы, а затем пять раз через 20-го калибра иглы.

Когда больше не видны крупные кусочки ткани, фильтруй суспензию через 40-микрометровый фильтр в 50-миллилитровую коническую трубку и собирайте клетки путем центрифугации. Для покрытия клеток и культуры, повторно приостановить гранулы в 0,5 миллилитров полного простаты эпителиальной среды роста клеток, и ссылаются на клетки в пять раз от 10 до пятой клетки на миллилитр простаты эпителиальной концентрации клеток. Смешайте клетки с внеклеточной матрицей мембраны подвала при соотношении два-три тома раствора и пластина клеточной подвески в соответствующем экспериментальном контейнере культуры клеток.

Затем поместите клетки в инкубатор культуры клеток на 30 минут. Когда внеклеточная матрица затвердела, покройте культуру предварительно разогретой полной средой роста эпителиальных клеток простаты, заботясь о том, чтобы не нарушить мембрану подвала внеклеточной матричной вилкой. Затем вернуть клетки в инкубатор культуры клеток в течение пяти-10 дней, освежая половину среды каждые два-три дня.

Для сбора сфер, аспирировать средний тщательно, не нарушая подвале мембраны внеклеточной матрицы гель штепсельной вилки, и добавить один миллилитр раствора Disbase для 100 микролитров мембраны подвала внеклеточной матрицы. Используя скребок клетки, соскребать вдоль нижней части пластины, чтобы поднять мембрану подвала внеклеточных гелей из нижней части пластины в супернатант, и труба весь раствор один раз, чтобы разбить вилку на более мелкие кусочки. Инкубировать дополнительные части клеточной матрицы в инкубаторе клеточной культуры в течение одного-двух часов, пока мембрана подвала внеклеточной матрицы полностью не растворилась.

Затем перенесите подвеску клетки в 15-миллилитровую трубку. И собирать клетки путем центрифугации для дальнейшего вниз по течению манипуляции. Простата мыши состоит из четырех пар долей, расположенных спинно и вентрализно семенных пузырьков и уретры.

Доли простаты состоят из нескольких профилей железы, каждый из которых состоит из люмена, в окружении секреторных эпителиальных клеток. Формы долей, организация клеток и характер секреции варьируются от доли до доли. Изолированные клетки простаты начинают расти в органоиды уже через четыре дня после мембраны подвала внеклеточной матрицы культуры.

В течение следующих одного-шести дней, большинство клеток вырастают в твердые сферы с долей сфер, проявляли частичный или полный люмен. Сфероиды также демонстрируют сильное бета-катенин окрашивание на клеточном стыке, которые ко-локализовать с F-актин окрашивания. При попытке этой процедуры, это очень важно тщательно следовать microdissection шаги.

Например, изолировать доли простаты, пока они все еще прикреплены к уретры, так что вы знаете, какая доля, которая основана на том, где они находятся по отношению к уретры. После процедуры вскрытия, изолированные доли могут быть использованы для анализа вниз по течению, таких как RMA секвенирования, западной blotting или иммуностеления. Основной метод 3D культуры позволяет получить дальнейшее понимание механизма рака простаты, потому что вы можете контролировать жизнь с сфероидами для морфологии и изменения поведения и определить любые неопластические изменения в том же.

Таким образом, это вскрытие простаты и методы культуры могут быть включены в различные приложения вниз по течению, чтобы предоставить ценную информацию для исследования механизма рака простаты с использованием генетически модифицированных моделей мыши.