Мониторинг Бегемот, сигнальный путь активности с помощью биосенсора супрессор (лат) на основе Люцифераза большой опухоли

Моя лаборатория изучает роль пути Hippo в развитии рака молочной железы и легких, и недавно мы разработали новый биосенсор для мониторинга сигнальной активности Hippo. Этот метод может быть использован для ответа на ключевые вопросы о сотовых сигнальных сетях, например, как путь Hippo реагирует на факторы и как он взаимодействует с другими сигнальными путями. Основным преимуществом этой методики перед существующими методами является ее большая чувствительность, а также возможность быстрой и одновременной обработки большого количества образцов.

Этот метод имеет разнообразное применение в фундаментальных и трансляционных исследованиях для изучения регуляторов сигнального пути Hippo как in vitro, так и in vivo. Для начала мини-подготовьте плазмиды LATS-BS только что из жидкой культуры бактерий DH5-Alpha. За час до трансфекции отсадите среду из тарелки, и добавьте в каждую лунку по 500 микролитров питательной среды.

Важным моментом является то, что биосенсор LATS должен быть приготовлен свежим, чтобы получить максимальную экспрессию и активность. Кроме того, рекомендуется всегда использовать восходящий регулятор пути Hippo, такой как MSD, в качестве положительного контроля при выполнении анализа люциферазы. После этого верните клетки в инкубатор

Затем приготовьте раствор А, раствор ДНК, и раствор В, разбавленный реагент для трансфекции на основе полимера, как описано в текстовом протоколе. После этого сразу же добавьте раствор Б в раствор А, и аккуратно пипеткой вверх и вниз перемешивайте. Инкубируйте образец при комнатной температуре в течение 15 минут, чтобы дать возможность образоваться трансфекционным комплексам.

Затем добавьте общий объем трансфекционных комплексов по каплям в каждую лунку пластины с легким закручиванием. Инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. На следующий день удалите среду, содержащую трансфекционный комплекс, и замените ее свежей готовой средой.

Затем культивируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение еще одного дня. Разбавьте соответствующее количество 5-кратного буфера пассивного лизиса дистиллированной водой. Затем полностью отсасывайте среду из пластины.

Добавьте по одному миллилитру PBS в каждую лунку и осторожно поворачивайте пластину, чтобы удалить отслоившиеся клетки и остаточные питательные среды. Затем полностью аспирируйте PBS. Далее добавьте в каждую лунку по 250 микролитров 1xPLB.

Поместите культуральную пластину на качающуюся платформу на 15 минут, чтобы обеспечить равномерное покрытие монослоя клеток PLB. После этого переложите лизат в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Извлеките LAR-2 из хранилища при температуре 80 градусов Цельсия и уравновесьте его до комнатной температуры.

Затем приготовьте реагент для обнаружения Рениллы для соответствующего количества анализов. Добавьте реагент для обнаружения Рениллы в 50-кратную подложку и буфер для нее. Далее дозируйте по 10 микролитров лизата каждой клетки в пробирки объемом 1,5 миллилитров.

Затем запрограммируйте люминометр на выполнение двухсекундной задержки предварительного измерения, за которой следует 10-секундный период измерения. Осторожно перелейте 20 микролитров реагента LAR-2 в одну пробирку, и быстро пипеткой вверх и вниз перемешайте. Затем сразу же поместите трубку в люминометр и начните считывание показаний.

После снятия показаний снимите пробирку с образцом из люминометра, добавьте 20 микролитров реагента Ренилла и пипеткой вверх и вниз перемешайте. Затем поместите образец в люминометр и инициируйте следующее измерение. Во-первых, культивируют, отделяют, подсчитывают и планшетируют Ad-клетки HEK293, как описано в текстовом протоколе.

Затем, за час до трансфекции, отсадите среду из тарелки и замените ее пятью миллилитрами свежей полной питательной среды. Наконец, добавьте разбавленный раствор В к раствору А и перемешайте пипеткой вверх и вниз. Затем инкубируйте образец при комнатной температуре в течение 15 минут, прежде чем добавить общий объем трансфекционных комплексов в планшет, при этом аккуратно помешивая.

Инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. На следующий день трипсинизируйте и посчитайте клетки. Планшет от 10 000 до 20 000 ячеек в каждую лунку 96-луночного планшета в общем объеме 100 микролитров среды на лунку.

После этого инкубируйте клетки еще один день. За один-четыре часа до проведения анализа люциферазы добавьте агенты, потенциально регулирующие путь Hippo, в конечной концентрации 10 микромоляров на лунку. Затем полностью отаспирируйте среду из клеток и промойте клетки в каждой лунке 100 микролитрами PBS.

Затем добавьте по 20 микролитров PLB в каждую лунку. Поместите тарелку для культуры на платформу-качалку на 15 минут. Затем перенесите по 20 микролитров реагента LAR-2 в каждую лунку планшета и пипеткой вверх и вниз для перемешивания.

Сразу после этого поместите пластину в пластинчатый считывающий люминометр и начните считывание показаний. В первой части этого протокола LATS-BS был котрансфицирован с различными генами для оценки их влияния на активность киназы LATS. Во втором протоколе LATS-BS трансфицировали в HEK293-Ad, а клетки пропускали в 96-луночные планшеты.

Через 40 часов после трансфекции клетки обрабатывали различными известными низкомолекулярными регуляторами передачи сигналов Hippo с последующим анализом люциферазы. При интерпретации результатов этих анализов следует отметить, что белки и лекарственные препараты могут активировать пути обратной связи, которые влияют на активность биосенсоров. Дальнейшие эксперименты потребуются для подтверждения связи между кандидатом и сигнальным путем бегемота.

После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как количественная ПЦР в реальном времени или вестерн-блоттинг, чтобы ответить на дополнительные вопросы об активности киназы LATS. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биологии рака к изучению динамики и активности сигнального пути LATS-киназы и Hippo во многих биологических и биохимических процессах. Не стоит забывать, что препараты для скрининга могут быть крайне опасными, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать соответствующие меры предосторожности.