Поколение 3D легкое человека тканевых культур (3D-LTCs) для моделирования заболевания
12 февраля 2019 г.
Здесь мы представляем собой протокол для подготовки заполнены агарозы легкое человека точности надреза кусочки от резекции тканей пациента которые подходят для создания 3D легких тканевых культур для модели человека легочных заболеваний в биологических и биомедицинских исследований.
Этот метод позволяет исследование живой человеческой ткани в его естественной 3D структуры и состава для перевода ключевых лабораторных выводов в потенциальных методов лечения. Этот метод специально позволяет поколению культур тканей из хирургически пересекретой или эксплантированной ткани легких человека для визуализации отдельных умерших образцов легочной ткани пациента. Безболезненные ткани легких могут быть использованы в качестве культуры 3D тканей для моделирования легочных заболеваний ex vivo, позволяющих анализ ранних патомеханизмов в высоком спатиотемпоральной резолюции.
Начните с размещения ресектированного образца легких в 15 миллилитров среды выращивания в стерильной 15-сантиметровой культуре блюдо и стерильный металлический лоток, покрытый салфеткой, и заполнить 30 миллилитров шприц с 42 градусов по Цельсию низкой плавильной точки агарозы. Снимите обтуратор с периферического венозного катетера и прикрепите катетер к 30 миллилитровому шприцу. Определите бронх диаметром от 0,5 до 3 миллиметров в вентиляциольной ткани в нетронутой части ткани и аккуратно вставьте канулу в бронхус, насколько это возможно.
Используйте щипцы для сжатия стенки бронхиола вокруг канулы, в идеале зажимая любые прилегающие легочной артерии в то же время, чтобы запечатать бронх вокруг канулы и использовать хирургический зажим, чтобы закрыть любые другие дополнительные дыхательные пути, чтобы предотвратить утечку агарозы. Далее, используйте типсы, чтобы поднять легочную ткань из культуры блюдо, и использовать шприц вручную доставить агарозу через канулу, не быстрее, чем 0,3 миллилитров в секунду. Когда легочная ткань заполнена полностью без чрезмерного надувания ткани, немедленно удалить канулу и зажим бронхов.
Погрузите ткань в культурную среду при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут, чтобы облегчить затвердевание агарозы, и повторите процедуру заполнения агарозы для любых дополнительных отверстий бронхиола. Затем храните заполненные агарозой участки легочной ткани в четырех градусах по Цельсию до нарезки. Для точного разрезания легких нарезки, определить прочно агарозы заполненные регионы в легочной ткани, которые не разрушаются при мягком нажатии пинцетом против нижней части клетки культуры блюдо.
Акциз от 1 до 1,5 кубических сантиметров блок прочно заполненной области с одной стороны по-прежнему покрыты плеврой, и использовать цианоакрилат клей, чтобы прикрепить множественной стороне каждого блока ткани вибромы держатель. Нарежьте весь путь через длинный блок ткани, пока только два-три милометра ткани остаются нелицеприятными. Использование типсов для передачи каждого 500-метрового сечения в один колодец двенадцати-хорошо пластины, содержащей культивирование среды, как они получены.
Когда все ткани были секционированы, передать образцы из каждого хорошо в отдельных десяти сантиметров культуры блюда и положение четыре миллиметра биопсии перфоратор ортогонально на верхнюю поверхность точного разреза легких ломтик. Затем, перемещая перфоратор по часовой стрелке и против часовой стрелки вращения, получить ткани ударов легких образца. Размещение каждого удара в свежей среде культуры клеток в отдельных колодцах 96-хорошо пластины, как они получены.
Когда все ткани удары были получены, поместите пластину в инкубатор культуры клеток на срок до пяти дней. Иммунолабелирование фибронектина в ядрах клеток с использованием иммунофторесценции в культурах 3-D легочной ткани человека позволяет получить изображение сохранившейся альвеолярной структуры ex vivo. Лечение человеческой точности сократить легких ломтик ударов с профибротической цитокинов коктейль в течение 48 часов приводит к фиброз-как изменения в человеческих легких 3-D культур ткани, в том числе значительное индукции фиброза соответствующих внеклеточных компонентов матрицы, коллагена типа один, и фибронектин генов.
Кроме того, уровни белка мезенхимального маркера виментина регулируются в трех из четырех пациентов после лечения 3-D легочной ткани культуры ударов. После этой процедуры, другие методы, такие как анализ РНК количественных ПЦР в режиме реального времени, или анализ белка западными blotting, могут быть выполнены для оценки экспрессии генов и белка соответственно в ткани. После его развития, этот метод проложил путь для исследований в области экспериментальной пульмонологии, для эксплантологии легких, а также для выполнения токсикологических и фармакологических исследований в образцах тканей человека.
Помните, что живые человеческие ткани потенциально инфекционные и что меры предосторожности, такие как использование личного защитного оборудования и надлежащего хранения тканей, транспортировки и обработки отходов, всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры
Обзор
В данной статье представлен протокол подготовки прецизионных срезов легкого человека, заполненных агарозой, из резекционной ткани пациентов. Такие срезы пригодны для создания трехмерных культур легочной ткани с целью моделирования заболеваний легких человека в биологических и биомедицинских исследованиях.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биомедицинские исследования
- Моделирование заболеваний легких
- Методы трехмерного культивирования тканей
Теоретические сведения
- Ткань легкого человека может быть использована для изучения заболеваний в естественной 3D-структуре.
- Данный метод позволяет визуализировать образцы легких отдельных пациентов.
- Он обеспечивает анализ ранних патомеханизмов с высоким пространственно-временным разрешением.
- В связи с инфекционной природой живой человеческой ткани необходимо соблюдение мер предосторожности.
Цель исследования
- Разработать протокол создания трехмерных (3D) культур легочной ткани.
- Обеспечить возможность изучения легочных заболеваний ex vivo.
- Обеспечить возможность анализа экспрессии генов и белков в легочной ткани человека.
Используемые методы
- Подготовка образцов легочной ткани с использованием низкоплавкого агарозы.
- Прецизионное разрезание срезов легкого, заполненных агарозой.
- Методы иммуномаркировки для визуализации структуры ткани.
- Анализ экспрессии генов и белков с помощью ПЦР и вестерн-блоттинга.
Основные результаты
- Индукция фиброзподобных изменений в культурах легочной ткани после обработки цитокинами.
- Повышение экспрессии генов коллагена I типа и фибронектина.
- Повышение уровней белка виментина, мезенхимального маркера, в обработанных образцах.
- Потенциал для дальнейших исследований в области экспериментальной пульмонологии и фармакологии.
Выводы
- Данный метод углубляет понимание биологии легких.
- Он служит платформой для токсикологических и фармакологических исследований.
- Будущие исследования могут опираться на этот метод для более совершенного моделирования заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Культуры трехмерных тканей легких человека, полученные из прецизионно отрезанных срезов легких, представляют собой физиологически релевантную модель ex vivo для изучения механизмов заболеваний и ответов на лекарственные препараты в нативной архитектуре тканей человека. Данный подход способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков, позволяя напрямую оценивать эффекты соединений в образцах пораженных легких или перитуморальных тканей отдельных пациентов. Модель повышает прогностическую достоверность доклинической оценки за счет сохранения клеточного разнообразия, состава внеклеточного матрикса и биомеханических свойств, имеющих критическое значение для трансляционной релевантности.
Стратегическое применение в исследованиях и разработках биофармацевтики
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы на интактной ткани легкого человека с сохраненной 3D-структурой и разнообразием типов клеток.
- Практическая ценность: обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем измерения вызванных препаратами изменений биомаркеров фиброза, таких как коллаген I типа и фибронектин.
- Научная ценность: способствует уточнению сигнальных путей посредством пространственно-временного анализа ранних патомеханизмов в релевантной ткани человека.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать стандартизированные, воспроизводимые образцы тканей (панчи), подходящие для скрининга соединений с использованием многолуночных планшетов.
- Практическая ценность: Обеспечивает количественный анализ с помощью иммунофлуоресценции, qPCR и вестерн-блоттинга для изучения зависимости «доза-эффект» и кинетики процессов.
- Научная ценность: Увеличивает выход тканей из ограниченных образцов пациентов за счет использования биопсийного панча, что повышает масштабируемость анализа и возможности репликации.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Моделирование специфических для человека фибротических процессов на субклеточном уровне с использованием вызванных цитокинами фиброзоподобных изменений в прецизионных срезах легких.
- Практическая ценность: Предоставление релевантной модели заболевания для оценки взаимодействия с мишенью и механизма действия в тканях человека перед проведением исследований in vivo.
- Научная ценность: Поддержка согласования трансляционных биомаркеров путем обеспечения корреляции между молекулярными показателями и функциональными результатами на уровне ткани.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в континуум поиска новых лекарственных средств — от раннего тестирования гипотез относительно мишеней через идентификацию ведущих соединений до доклинической валидации, что позволяет проводить итерационную оптимизацию на основе ответов тканей человека.
- Поисковая биология: облегчает проверку гипотез, обеспечивая визуализацию структуры альвеол и клеточных ответов в интактных эксплантах легкого человека.
- Скрининг: позволяет получать готовые к анализу биоптаты тканей однородного размера и жизнеспособности для скрининга библиотек соединений в 96-луночных форматах.
- Аналитика: обеспечивает возможность мультиплексного считывания данных, включая экспрессию генов (qPCR), уровни белков (вестерн-блоттинг) и структурную визуализацию (иммунофлуоресценция) для сравнения условий обработки.
- Трансляционные исследования: связывают поисковую и доклиническую работу, сохраняя сложность человеческих тканей и позволяя проводить анализ ответов с учетом стратификации пациентов.
- Корпоративное повторное использование: создает многоразовую платформу для моделирования заболеваний легких, которая может быть применена в нескольких проектах и терапевтических областях.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования за счет сокращения разрыва в трансляции между видами благодаря прямому использованию тканей легкого человека.
- Практическая ценность: Стандартизирует подготовку тканей с помощью включения в агарозу и прецизионного срезания, что повышает воспроизводимость результатов разными пользователями и в разных центрах.
- Стратегическая ценность: Обосновывает решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), предоставляя ранние сигналы об эффективности и токсичности на основе тканей человека.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию соединений с учетом рисков на основе механистических эффектов в образцах пораженных легких или перитуморальных тканей человека.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с тканями человека, владение методами стерильной обработки и навыками секционирования на вибратоме.
- Зависит от наличия доступа к хирургически удаленным тканям легких и агарозе с низкой температурой плавления для сохранения структуры.
- Требуются стандартизированные условия культивирования и контроль контаминации в связи с инфекционным потенциалом живых тканей человека.
- Требуется оптимизация размера биопсийного панча и техники ротации для обеспечения единообразия образцов в повторностях.
- Ограничено окном жизнеспособности тканей, что требует своевременной обработки и запуска культивирования после резекции.
