Использование электронного парамагнитного резонанса в биологических образцах при окружающей температуре и 77 K
11 января 2019 г.
Спектроскопия парамагнитного резонанса (EPR) является недвусмысленным метод измерения свободных радикалов. Использование селективного спин зондов позволяет для обнаружения свободных радикалов в различных клеточных отсеках. Мы представляем практический и эффективный метод для сбора биологических проб, которые облегчают обработки, хранения и передачи образцы для измерения ОРЭД.
Дисрегулируемая красная сигнализация вовлечена в патогенез различных заболеваний. Изучение биологии редокса требует точного обнаружения реактивных видов кислорода в различных клеточных и тканевых отсеках. Спектроскопия EPR является единственным методом, который измеряет свободные радикалы однозначно.
Этот протокол демонстрирует практический метод обработки и хранения биологических образцов для спектроскопии ЭПР. Эти протоколы иллюстрируют использование EPR и спин-зондов в двух репрезентативных моделях. Хотя они могут быть адаптированы для оценки активных видов в других биологических условиях.
Конструкция эксперимента и обработка образца имеют решающее значение для его воспроизводимости. Мы рекомендуем учитывать плотность клеток и обеспечивать надлежащие элементы управления, соответствующие времени. Начните с мягкого мытья сырых 264,7 клеток с одним миллилитров Кребс-Хенселейт буфер или KHB, на колодец.
И лечить клетки с 500 микролитров KHB, дополненный 100 микромил DTPA на колодец. Чтобы предварительно обработать супероксиддисмутазой, добавьте 15 микролитров бульона супероксиддисмутазы, или транспортного средства, к каждой хорошо, и поместите пластину при 37 градусах по Цельсию в течение 10 минут. В конце предварительной обработки супероксиддисмутазы добавьте 12,5 микролитров 10 миллимоляров CMH и 40 микролитров 125 микромоляров PMA рабочего раствора к соответствующим скважинам и инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение 50 минут.
Немедленно поместите пластины на лед и соберите буфер из каждого колодец в отдельные 1,5 миллилитровые трубки на льду. Затем добавьте 100 микролитров свежего KHB плюс DTPA к каждому колодец и аккуратно соскреблите клетки со дна каждой хорошо. Затем повторное использование клеточных суспензий с пипетками и передача клеток в отдельные 1,5 миллилитровые трубки на льду.
Для обнаружения супероксида при комнатной температуре сначала загрузите 50 микролитров одного буфера или образца клетки в капиллярную трубку и запечатайте трубку. Немедленно поместите трубку в электронный парамагнитный резонанс, или спектрометр EPR, и установите параметры приобретения EPR для измерения комнатной температуры. Всегда проверьте пустой образец буфера, содержащий ту же концентрацию зонда, обработанного в тех же экспериментальных условиях, что и контроль.
Для обнаружения супероксида при 77 градусах Кельвина загрузите 150 микролитров одного образца в кусок прямого полиэтилена размером от одного до двух дюймов, или PTFE, трубки, с резиновой пробкой на одном конце. Печать другой конец трубки со второй пробкой и вспышки заморозить образец в жидком азоте. Затем быстро удалите пробки и поместите трубки PTFE в помеченную криотрубку для хранения жидкого азота.
Для измерений ЭПР заполните двойку пальца спектрометра EPR жидким азотом и поместите трубки PTFE, содержащие образец в жидком азоте. Поместите двойку пальца в спектрометр EPR и установите параметры приобретения EPR для измерений на 77 градусов Кельвина. Для обнаружения ROS в замороженных тканях легких поместите ткань на сухой лед и используйте пинцет для стабилизации флэш-замороженной ткани на сухом льду.
Разрежьте образец на пять 15 миллиграммов кусочки и взвесьте кусочки в смоляной трубке весом 1,5 миллилитров. Добавьте 196 микролитров KHB плюс DTPA и четыре микролитера CMH в образец, и инкубировать образец легких в течение одного часа в 37 градусов по Цельсию водяной бане, прежде чем гранулировать фрагменты ткани с краткой центрифугации. Затем поместите образец на лед перед передачей 150 микролитров супернатанта в кусок трубки PTFE для флэш-замораживания при подготовке измерения EPR, как только что продемонстрировано.
Оценка общего производства супероксида в необработанных 264,7 клеток, стимулируемых ПМА, как было продемонстрировано, показывает, что концентрация нитроксида как в клеточной суспензии, так и в буфере обработанных ПМА клеток аналогична, благодаря проницаемому характеру и быстрой эквилибрации спинового зонда. Нитроксидные радикалы сигнал увеличивается в сырых 264,7 клеток стимулируется с ПМА, по сравнению с контрольными клетками, но не в клетках, предварительно обработанных клеточной непроницаемой супероксид дисмутазы. Концентрация нитроксида, полученного при низких температурах в сырых 264,7 клетках после стимуляции с помощью ПМА, также затухается при наличии дисмутазы супероксида в соответствии с данными комнатной температуры.
Концентрация нитроксида увеличивается в крови и бронхоальвеолярной жидкости лаважа мышей блео и обработанных мышей, а также в супернатантах собранных частей легочной ткани от мышей блео и раненых животных, по сравнению с обработанными PBS контролем. Кроме того, после инъекции ретро-орбитального спина зонда, bleo мышей и обработанных животных демонстрируют более высокий сигнал зонд спина по сравнению с управления. Эти практические протоколы позволят исследователям протестировать свободное радикальное производство в различных клеточных отсеках и биологические образцы ЭПР, включая измерения низкой температуры.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен практический метод сбора и подготовки биологических образцов для спектроскопии электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). ЭПР является уникальным методом однозначного измерения свободных радикалов, которые играют важнейшую роль в редокс-биологии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Редокс-биология
- Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР-спектроскопия)
- Детекция свободных радикалов
Теоретические сведения
- Нарушение окислительно-восстановительной сигнализации связано с различными заболеваниями.
- Точное определение активных форм кислорода имеет важное значение для биологических исследований.
- ЭПР-спектроскопия является единственным методом, обеспечивающим однозначное измерение свободных радикалов.
- Данное исследование сосредоточено на протоколах обращения с биологическими образцами и их хранения.
Цель исследования
- Продемонстрировать практический метод сбора образцов для ЭПР-спектроскопии.
- Проиллюстрировать использование селективных спиновых зондов в биологических системах.
- Представить протоколы, которые могут быть адаптированы для различных биологических моделей.
Используемые методы
- Сбор биологических образцов для ЭПР-измерений.
- Использование селективных спиновых зондов для детектирования свободных радикалов.
- Протоколы подготовки и хранения образцов.
- Применение методов на репрезентативных биологических моделях.
Основные результаты
- Данные протоколы эффективно упрощают работу с образцами и их хранение.
- ЭПР-спектроскопия обеспечивает надежное измерение концентрации свободных радикалов.
- Спиновые зонды могут быть адаптированы для различных биологических условий.
- Исследование демонстрирует универсальность метода ЭПР в редокс-биологии.
Выводы
- ЭПР-спектроскопия является ценным инструментом для изучения свободных радикалов.
- Правильное обращение с образцами имеет решающее значение для получения точных результатов измерений.
- Представленные методы могут способствовать развитию исследований в области редокс-биологии.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Точное обнаружение активных форм кислорода (АФК) имеет решающее значение для понимания редокс-сигналинга в механизмах заболеваний и валидации мишеней. Спектроскопия электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) обеспечивает однозначное прямое измерение свободных радикалов, что позволяет снизить механистические риски на ранних этапах поиска лекарственных средств. Данный метод повышает прогностическую достоверность, позволяя проводить количественный анализ АФК в конкретных компартментах клеточных моделей и моделей тканей, что служит основой для принятия решений о целесообразности продолжения доклинических программ.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем обнаружения физиологических уровней конкретных форм АФК с высокой специфичностью.
- Практическая ценность: позволяет дифференцировать внеклеточный и цитозольный супероксид с помощью проникающих в клетку зондов и контроля с использованием СОД, что проясняет участие соответствующих путей.
- Прогностическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет количественных измерений супероксида с разделением по компартментам в моделях, релевантных для данного заболевания.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: подготовка валидированных биологических систем для последующих этапов рабочего процесса посредством стандартизированного маркирования спиновыми зондами и стабилизации образцов.
- Воспроизводимость: возможность хранения образцов при -80°C и анализа при 77 K, что обеспечивает согласованность результатов ЭПР-измерений между разными партиями и центрами.
- Масштабируемость: обеспечение надежной оценки соединений за счет возможности переноса и повторного использования замороженных образцов для высокопроизводительного скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: обеспечивает определение супероксида в тканях легких, крови и жидкости бронхоальвеолярного лаважа в моделях повреждения, что способствует согласованию трансляционных биомаркеров.
- Преклиническая преемственность: связывает результаты исследований in vitro с моделями in vivo за счет использования идентичных стратегий детектирования со спиновыми зондами (например, CPH, mito-TEMPO-H).
- Оптимизация прогресса с учетом рисков: предоставляет данные для принятия решений о дальнейшем продвижении исследований, подтверждая взаимодействие с мишенью посредством модуляции АФК в соответствующих патофизиологических контекстах.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
ЭПР-спектроскопия вписывается в континуум исследований от валидации мишени до доклинической валидации, обеспечивая ортогональное подтверждение механизмов воздействия на редокс-сигналинг.
- Биология открытий: Обеспечивает проверку гипотез путем количественного определения супероксида в конкретных клеточных компартментах с использованием селективных спиновых зондов и ферментативного контроля.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа за счет воспроизводимой подготовки образцов и криоконсервации, что позволяет получать стабильные показатели свободных радикалов для библиотек соединений.
- Аналитика: Генерирует количественные нитроксидные сигналы, пропорциональные концентрации супероксида, что позволяет сравнивать условия и оценивать дозозависимый ответ.
- Трансляционные исследования: Связывает этап открытий с доклинической валидацией путем обнаружения АФК в супернатантах полученных тканей и биологических жидкостях моделей заболеваний.
- Корпоративное использование: Создает многократно используемую платформу для редокс-профилирования в различных терапевтических областях, сокращая избыточную разработку методов.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Обеспечивает однозначное обнаружение свободных радикалов, снижая механистическую неопределенность при валидации окислительно-восстановительных путей.
- Операционная ценность: Гарантирует воспроизводимость за счет стандартизированной кинетики спиновых зондов, контролируемой подготовки образцов и возможности проведения измерений при низких температурах.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет получения прямых доказательств мишень-опосредованной модуляции ROS, что снижает вероятность неудач на поздних стадиях биологических исследований.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию с учетом рисков путем подтверждения механистической точности действия соединений в соответствующих моделях заболеваний.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области ЭПР-спектроскопии и химии спиновых зондов для правильного подбора зонда и интерпретации данных.
- Требуется доступ к ЭПР-спектрометру с возможностью проведения измерений как при комнатной температуре, так и при 77 K.
- Необходимы стандартизированные протоколы определения плотности клеток, времени инкубации и использования соответствующих контролей для обеспечения сопоставимости данных.
- Требуется адаптация методов для различных модельных систем (например, культивируемых клеток и ткани легкого) в отношении доставки зонда и обработки тканей.
- Существуют практические ограничения, включая необходимость использования специализированных трубок, устойчивых к криогенным температурам, и осторожное обращение для предотвращения деградации спинового зонда.
