Анализ отклонений β-амилоид индуцированной фибринового сгустка структуры спектроскопии и растровая электронная микроскопия
30 ноября 2018 г.
Здесь представлены два метода, которые могут использоваться отдельно или в сочетании для анализа воздействия бета амилоида на структуру сгусток фибрина. Включено — это протокол для создания фибрина в vitro сгусток, следуют сгусток мутность и растровая электронная микроскопия методы.
Основным преимуществом этого анализа мутности на основе пластины является то, что он быстр и позволяет проверять сразу несколько ингибиторов взаимодействия амилоидно-бета фибриногена без сложной настройки или требований. Головные соединения, которые находятся в анализе мутности фибрина, могут быть дополнительно оценены за их способность восстановить А-бета-индуцированной структурной аномалии в сгустках фибрина, проанализированных путем сканирования электронной микроскопии. Визуальная демонстрация подготовки сгустка для сканирования анализа электронной микроскопии имеет решающее значение, поскольку любые изменения в препарате могут способствовать вариациям в экспериментальных результатах.
Основное внимание в этой демонстрации здесь уделяется A-бета фибриноген взаимодействий. Этот протокол можно легко модифицировать для анализа других взаимодействий с другими белками и соединениями с сгустком фибрина. Начните с добавления 1,5 микромолара свежеприготовленного фибриногена в 200 микролитров буфера образования тромбов к каждому A-бета отрицательному 42, содержащем и контролю скважин и инкубировать пластину на вращающейся платформе при комнатной температуре.
Через 30 минут одновременно добавьте 30 микролитров свежеприготовленного раствора тромбина непосредственно в центр фибриногенсодержащего хорошо, чтобы инициировать образование тромба и сразу же прочитайте поглощение тромбов in vitro на 350 нанометров, повторяя измерение каждые 30-60 секунд в течение 10 минут. Для оценки влияния ингибиторов взаимодействия A-beta fibrinogen на структуру сгустка фибрина, сначала используйте типсы, чтобы поместить чистый, 12-миллиметровый силиконовый стеклянный круг крышка скользит к отдельным скважинам 12 пластины скважины и добавить 80 микролитров фибриногена на каждой крышке скольжения, мягко распространяя раствор так, что они равномерно распределены. Добавьте 20 микролитров раствора тромбина в каждую колодец, чтобы инициировать образование тромбов.
Обложка пластины в течение 30 до 60 минут инкубации при комнатной температуре, а затем осторожно погрузить каждый сгусток в два миллилитров ледяного буфера какодилата натрия в течение двух минут, покрытые, при комнатной температуре в два раза, используя один миллилитр пипетки тщательно удалить буфер после каждой стирки. После последней стирки проверьте состояние образования сгустка на крышке скольжения и исправить сгустки в два-три миллилитров ледяной 2%glutaraldehyde на льду в течение 30 минут. В конце инкубации аккуратно удалите глутаралдегид из каждого хорошо и мыть сгустки со свежим буфером какодилата натрия, как попродемонстрировано на льду.
Для увлажнения фиксированных сгустков в градуированной серии из пяти минут ледяного этанола моет на льду, не полностью удаляя этанол между моет держать сгустки защищены от воздействия воздуха. Во время последнего 100%ethanol мыть, передача крышка скользит в критической точке сушилки образца держателя, размещение по крайней мере 1 шайба между каждой крышкой скольжения и место держателя в критическую точку сушилки камеры заполнены этанолом. После 30-минутного цикла сушки используйте углеродную ленту для установки крышки скользит по отдельным сканирующей электронной микроскопии заглушек и передачи образцов в камеру покрытия распыления вакуумного распылитель.
Затем распыление пальто менее 20 нанометров золотого палладия или других проводящих материалов на образцы в течение 25 секунд при четырех ангстремах в секунду и изображение образцов на сканирующем электронном микроскопе, оборудованном детектором вторичных электронов типа два на четыре киловольты. Образование сгустка Фибрина вызывает рассеяние света, проходящего через раствор, что приводит к повышенной мутности, что плато в конце периода чтения. Когда фибриноген инкубируется в присутствии A-beta 42 мутность раствора уменьшается с кривой, достигаемой максимальной высоты примерно в два раза, что фибриногена в одиночку.
При наличии блокатора взаимодействия A-beta 42 эффект бета-амилоида омлеяется, а мутность выше, чем при одной только А-бета. Эффект блокатора не появляется из-за фоновой мутности, так как соединение не меняет мутность сгустка фибрина, когда отсутствует A-бета. Кроме того, образование тромбов в присутствии GPRP, пептида, который, как известно, мешает полимеризации фибрина, демонстрирует значительно сниженную мутность по сравнению с образованием сгустка фибрина в отсутствие ингибитора.
Фибриноген, генерируемый при наличии тромбина и хлорида кальция, образуют только фибриновую сетку с удлиненными и интеркалированными нитями фибрина, а также более крупными пучками. Когда A-бета присутствует, нити фибрина стали тоньше с несколькими липкими сгустками в агрегатах, что указывает на А-бета индуцированных структурных аномалий. В соответствии с результатами анализа мутности, образование тромба в присутствии блокатора взаимодействия A-beta fibrinogen частично восстанавливает структуру сгустка фибрина от изменений, вызванных А-бета, поскольку с помощью этого лечения наблюдается меньше комков.
Анализ мутности сгустка и протоколы анализа электронного микроскопа были оптимизированы для оценки нескольких ингибиторов взаимодействия фибриногена A-бета быстрым и воспроизводимым образом. И вскоре данные предоставят ценную информацию о образовании сгустка фибрина, которая может быть применена к дальнейшим исследованиям как in vitro, так и in vivo.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлены методы анализа влияния бета-амилоида на структуру фибринового сгустка, включая протокол создания фибринового сгустка in vitro, а также методы измерения мутности сгустка и сканирующей электронной микроскопии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биохимия
- Клеточная биология
Теоретическая часть
- Бета-амилоид участвует в развитии нейродегенеративных заболеваний.
- Фибриновые сгустки играют роль в различных биологических процессах.
- Понимание структуры фибринового сгустка может дать представление о механизмах заболеваний.
- Предыдущие исследования выявили структурные аномалии в фибриновых сгустках, вызванные A-beta.
Цель исследования
- Оценить влияние бета-амилоида на структуру фибринового сгустка.
- Провести скрининг ингибиторов взаимодействия амилоида-бета с фибриногеном.
- Продемонстрировать способ подготовки сгустков для анализа методом сканирующей электронной микроскопии.
Используемые методы
- Анализ мутности на планшетах для быстрого скрининга.
- Подготовка сгустков фибрина in vitro с использованием фибриногена.
- Сканирующая электронная микроскопия для анализа структуры сгустка.
- Модификация протоколов для изучения других белковых взаимодействий.
Основные результаты
- Идентификация ведущих соединений, восстанавливающих структурную целостность.
- Визуальная демонстрация приготовления сгустка имеет решающее значение для обеспечения воспроизводимости.
- Различия в способе приготовления могут повлиять на результаты эксперимента.
- Потенциал для более широкого применения в изучении белковых взаимодействий.
Выводы
- Представленные методы эффективны для анализа структуры фибринового сгустка.
- Скрининг ингибиторов может помочь в понимании терапевтических стратегий.
- Дальнейшие исследования могут расширить представления о взаимодействии других белков.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный протокол позволяет проводить быстрый и воспроизводимый скрининг ингибиторов взаимодействия амилоида-бета с фибриногеном с помощью планшетного анализа мутности, что способствует валидации мишеней на ранних этапах разработки терапевтических средств для лечения болезни Альцгеймера. Метод предоставляет количественные данные о формировании сгустков и структурное подтверждение с помощью сканирующей электронной микроскопии, что облегчает переход от стадии поиска хитов к оптимизации лидов для соединений, которые устраняют аномалии фибриновых сгустков, индуцированные A-beta. Благодаря интеграции показателей мутности с SEM-визуализацией, данный подход обеспечивает механическое снижение рисков и прогностическую уверенность для программ поиска препаратов, нацеленных на нейрососудистую систему.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверить терапевтическую гипотезу о том, что взаимодействие A-beta с фибриногеном способствует патологическому образованию тромбов при болезни Альцгеймера.
- Практическая ценность: Обеспечивает функциональную валидацию мишени путем измерения мутности сгустка как прямого показателя ингибирования связывания A-beta с фибриногеном.
- Прогностическая ценность: Помогает в приоритизации портфеля препаратов путем выявления соединений, восстанавливающих нормальную структуру фибринового сгустка, что свидетельствует о взаимодействии с мишенью и снижении биологических рисков.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Оптимизированный метод анализа мутности является экспресс-методом, обладает высокой воспроизводимостью и совместим с форматом многолуночных планшетов для скрининга обширных библиотек соединений.
- Количественный результат: Измеряет оптическую плотность при 350 nm с течением времени, предоставляя кинетические данные о формировании сгустка, что позволяет отличить эффективность ингибитора от фоновых эффектов.
- Структурное подтверждение: Соединения-хиты, выявленные в ходе скрининга мутности, валидируют с помощью СЭМ для визуализации восстановления архитектуры фибринового сгустка, чтобы убедиться, что полученные результаты не являются артефактами анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для исследования заболеваний: Моделирует цереброваскулярный механизм патологии болезни Альцгеймера, связывая A-beta с аномалиями фибринового сгустка, которые ассоциированы с микроинфарктами и церебральной амилоидной ангиопатией.
- Трансляционная преемственность: Связывает воздействие на мишень in vitro (мутность) с фенотипической структурой сгустка (SEM), что способствует механическому снижению рисков перед валидацией in vivo.
- Продвижение с учетом рисков: Позволяет принимать решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) на основе двух критериев: задержки формирования сгустка и обращения структурных аномалий.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум ранних этапов поиска лекарств, позволяя проверить гипотезу о взаимодействии A-beta-фибриногена как потенциальной мишени для терапии, при этом полученные результаты используются в рабочих процессах идентификации ведущих соединений и доклинической валидации.
- Биологические исследования: позволяет проверить гипотезы путем количественного определения того, как A-beta изменяет мутность и структуру фибринового сгустка, что проясняет роль данных путей в нейроваскулярной дисфункции.
- Скрининг: обеспечивает готовность и воспроизводимость анализа для высокопроизводительной оценки ингибиторов взаимодействия A-beta-фибриногена в формате 96-луночного планшета.
- Аналитика: предоставляет кинетику мутности и структурные показатели на основе СЭМ, что позволяет проводить сравнительный анализ влияния соединений на формирование и архитектуру сгустка.
- Трансляционные исследования: связывает ингибирование мишени с фенотипическим восстановлением сгустка, что соответствует принципам доклинической преемственности для нейроваскулярных моделей болезни Альцгеймера.
- Повторное использование в организации: рабочий процесс «мутность-СЭМ» представляет собой многократно используемую платформу, применимую к другим белково-фибриногеновым взаимодействиям, помимо A-beta, что способствует широкому поиску и валидации мишеней.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Обеспечивает прогностическую достоверность путем установления связи между биохимическим ингибированием и структурным восстановлением тромба, что снижает механистическую неопределенность при валидации мишени.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость за счет оптимизированных протоколов подготовки, промывки, фиксации и визуализации тромбов.
- Стратегическая ценность: Повышает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет требования как функциональной (турбидиметрия), так и структурной (СЭМ) валидации, что снижает биологические риски на поздних этапах.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию ингибиторов с учетом рисков, выбирая те, которые демонстрируют двойную коррекцию — задержку формирования тромба и устранение структурной патологии.
Особенности реализации
- Требуется опыт в подготовке белков, проведении анализов на образование сгустков и подготовке образцов для сканирующей электронной микроскопии.
- Необходим доступ к планшетному ридеру, способному выполнять кинетические измерения абсорбции при 350 nm, и к вакуумному напылителю с возможностью получения СЭМ-изображений.
- Необходима стандартизация этапов фиксации, дегидратации и сушки сгустков во избежание появления структурных артефактов, которые могут затруднить интерпретацию данных СЭМ.
- При адаптации протокола для изучения других взаимодействий белков с фибриногеном следует учитывать особенности состава буфера и времени инкубации.
- Существуют практические ограничения, такие как необходимость приготовления свежих реагентов и осторожное обращение с образцами для предотвращения вариабельности сгустков из-за воздействия воздуха или неравномерного промывания.
