Количественные полимеразной цепной реакции на основе анализ мышиных кишечной микробиоты после устные лечения антибиотиками

Этот протокол обеспечивает надежный метод количественной оценки изменений кишечной микробиоты мышей после перорального введения антибиотиков. Это может помочь исследованиям по взаимодействию перекрестной микробиоты, обеспечивая понимание патологий, связанных с микробным дисбактериозом, таких как воспалительные заболевания кишечника. Основным преимуществом этих режимов лечения антибиотиками является то, что они предотвращают характерную потерю веса, обычно связанную с пероральным применением антибиотиков мышам.

Для подготовки лечения антибиотиками с помощью перорального гаважа подготовить коктейль антибиотиков путем смешивания фондовых решений, которые были подготовлены, как описано в техническом протоколе. Для объема миллилитров смешайте 50 микролитров ампициллина, 50 микролитров гентамицина, 50 микролитров неомицина, 500 микролитров метронидазола, 25 микролитров ванкомицина и 325 микролитров воды. Загрузите смесь антибиотиков на один миллилитрный шприц, устраняя при этом пузырьки и прикрепите соответствующую иглу гаге.

Возьмите кожу через плечо мыши твердо и растянуть голову и шею, чтобы выпрямить пищевод. Навемите кончик иглы для кормления вдоль крыши рта и к задней части глотки. Затем аккуратно передать его в пищевод и ввести 200 микролитров раствора.

Администрирование антибиотика коктейль один раз в день в течение всего эксперимента. Кроме того, для введения антибиотиков через питьевую воду, подготовить коктейль антибиотиков, как описано в техническом протоколе. Важно включить подсластитель в смесь антибиотиков, так как это является решающим фактором для предотвращения обезвоживания мышей.

Заполните антибиотик коктейль в бутылку с водой на уровне около 100 миллилитров за бутылку. Защитите бутылку от света и поместите в клетку мыши. Замените антибиотик коктейль свежим бульоном два раза в неделю в течение всего эксперимента.

Тщательный мониторинг веса мышей и общего состояния здоровья должен быть заранее ежедневно на протяжении всего введения антибиотиков. Взвешивание и маркировка двух миллилитровых автоклавных трубок для сбора образцов. Для сбора свежих образцов стула поместите каждую мышь в ретюлер.

Затем собирайте фекальные гранулы прямо из ануса в трубке коллекции. После выполнения эвтаназии, как описано в техническом протоколе лежал туша мыши с животом полностью подвергаются и спрей брюшной области с 70%этанола. Использование стерилизованных типсов и ножниц сделать поперечный разрез в брюшной полости подвергать peratenium без повреждения каких-либо внутренних тканей.

Поднимите peratenium и сделать разрез, чтобы разоблачить кишечник. Удалите кишечник с помощью типсов и ножниц и поместите его в стерильную чашку Петри. Тщательно используйте типсы, чтобы дразнить тонкой кишки от мезентерных артерий и жира.

Расширяй кишечник и пойми его на чистую лабораторную салфетку. С помощью меры линейки и вырезать четыре сантиметра дистальной илеи тонкой кишки. Вырезать и отбросить один сантиметр кишечника проксимальной к cecum.

Там будет три сантиметра часть илея слева, которые будут использоваться для сбора кишечных бактерий. Держите часть ileum над 2 миллилитровыми стерильными пробками. Соберите содержимое кишечника, непосредственно выдавлив кишечник и собирая образец в трубке.

Этот образец будет иметь бактерии из содержания илея. Приготовьте 20 миллилитровый шприц с холодным фосфатом буферного солевого раствора и промыть часть илея отбрасывая поток до конца. Поместите порцию илеума на стерильную чашку Петри и откройте ее продольно ножницами.

Очистите внутреннюю часть стенки илеума скальпелем. Соберите любые бактерии на скальпеле, стирая его с одним миллилитров PBS над чистой трубкой центрифуги. Спин на восемь тысяч раз G в течение пяти минут, чтобы гранулы бактерий.

После центрифугации отбрасывают супернатант. Этот образец будет содержать бактерии из стенки илеума. Взвесь трубки, содержащие образцы стула и илея.

Вычесть вес из пустых трубок, чтобы получить фекальный вес в каждом образце. Извлекайте бактериальную ДНК из стула, содержания илея и образцов стенок илея с использованием коммерчески доступных комплектов. Храните образцы ДНК при температуре минус 20 градусов по Цельсию до их использования.

Оттепель qPCR стандарт, фекальный образец ДНК и qPCR реагентов из коммерчески доступных комплект на льду. Разбавить стандарт в стерильной ДНК свободной воды в диапазоне от 10 до 7 до 10 до двух копий на микролитер. Разбавить фекальный образец ДНК до половины, одной пятой и одной десятой концентрации.

Затем сделайте мастер смесь реакции на общее количество реакций плюс один. Смешайте 30 микролитров мастер-микса и 5 микролитров шаблона, который является либо стандартом, образцом, либо водой для отрицательного контроля. Затем добавьте 10 микролитров этой смеси к каждой хорошо в 384 хорошо оптической пластины qPCR.

Выполните каждую реакцию в три раз. Печать пластины qPCR и центрифуги кратко. Затем загрузите пластину на машину qPCR, которая программирована как указанная в техническом протоколе.

Наконец, получить пороговые значения цикла для стандарта и образцов перед расчетом номеров копирования 16S rDNA для фекальных образцов. Репрезентативные результаты показывают потерю веса у мышей после введения антибиотиков пероральными гаважами или через питьевую воду. Нет заметной потери веса обнаруживается у мышей, которые получают антибиотики устные gavage.

Когда мышей лечат антибиотиками в питьевой воде они потерять около 10% от их веса тела в течение первых нескольких дней лечения, но восстановить нормальный прирост веса после этого. Количественная оценка бактерий в фекальных образцах требует использования стандартной кривой, полученной путем построения логаритма номера копии для стандарта по сравнению со значениями C-T, полученными в qPCR. В линейном диапазоне уравнение регрессионного анализа позволяет количественно оценить изобилие 16S rDNA в фекальных образцах.

Как показано здесь для стула, тонкой кишки содержание и тонкой кишки стенки образцов. После пяти или 10 дней перорального введения антибиотиков существует сильное снижение плотности бактерий в образцах стула от антибиотиков лечение мышей. Однако плотность бактерий в кале восстановилась до нормального уровня через неделю после того, как применение антибиотиков было остановлено.

Как устные gavage и введения антибиотиков в питьевой воде кратко уменьшить фекальные бактериальной нагрузки у обработанных мышей. Исследователи, которые выбирают индивидуальный метод, который лучше соответствует экспериментальным требованиям, учитывая такие факторы, как продолжительность лечения. Метод qPCR для количественной оценки бактерий может быть изменен для количественной оценки отдельных бактериальных такс с использованием конкретных грунтовок.

Это даст как количественную, так и квалитивную информацию о размере и составе микробиома.