Количественные полимеразной цепной реакции на основе анализ мышиных кишечной микробиоты после устные лечения антибиотиками
November 17th, 2018
Здесь мы предоставляем подробные протоколы для орального применения антибиотиков для сбора фекальных проб, экстракции ДНК и количественного определения фекальных бактерий, мышей, ПЦР.
Этот протокол обеспечивает надежный метод количественной оценки изменений кишечной микробиоты мышей после перорального введения антибиотиков. Это может помочь исследованиям по взаимодействию перекрестной микробиоты, обеспечивая понимание патологий, связанных с микробным дисбактериозом, таких как воспалительные заболевания кишечника. Основным преимуществом этих режимов лечения антибиотиками является то, что они предотвращают характерную потерю веса, обычно связанную с пероральным применением антибиотиков мышам.
Для подготовки лечения антибиотиками с помощью перорального гаважа подготовить коктейль антибиотиков путем смешивания фондовых решений, которые были подготовлены, как описано в техническом протоколе. Для объема миллилитров смешайте 50 микролитров ампициллина, 50 микролитров гентамицина, 50 микролитров неомицина, 500 микролитров метронидазола, 25 микролитров ванкомицина и 325 микролитров воды. Загрузите смесь антибиотиков на один миллилитрный шприц, устраняя при этом пузырьки и прикрепите соответствующую иглу гаге.
Возьмите кожу через плечо мыши твердо и растянуть голову и шею, чтобы выпрямить пищевод. Навемите кончик иглы для кормления вдоль крыши рта и к задней части глотки. Затем аккуратно передать его в пищевод и ввести 200 микролитров раствора.
Администрирование антибиотика коктейль один раз в день в течение всего эксперимента. Кроме того, для введения антибиотиков через питьевую воду, подготовить коктейль антибиотиков, как описано в техническом протоколе. Важно включить подсластитель в смесь антибиотиков, так как это является решающим фактором для предотвращения обезвоживания мышей.
Заполните антибиотик коктейль в бутылку с водой на уровне около 100 миллилитров за бутылку. Защитите бутылку от света и поместите в клетку мыши. Замените антибиотик коктейль свежим бульоном два раза в неделю в течение всего эксперимента.
Тщательный мониторинг веса мышей и общего состояния здоровья должен быть заранее ежедневно на протяжении всего введения антибиотиков. Взвешивание и маркировка двух миллилитровых автоклавных трубок для сбора образцов. Для сбора свежих образцов стула поместите каждую мышь в ретюлер.
Затем собирайте фекальные гранулы прямо из ануса в трубке коллекции. После выполнения эвтаназии, как описано в техническом протоколе лежал туша мыши с животом полностью подвергаются и спрей брюшной области с 70%этанола. Использование стерилизованных типсов и ножниц сделать поперечный разрез в брюшной полости подвергать peratenium без повреждения каких-либо внутренних тканей.
Поднимите peratenium и сделать разрез, чтобы разоблачить кишечник. Удалите кишечник с помощью типсов и ножниц и поместите его в стерильную чашку Петри. Тщательно используйте типсы, чтобы дразнить тонкой кишки от мезентерных артерий и жира.
Расширяй кишечник и пойми его на чистую лабораторную салфетку. С помощью меры линейки и вырезать четыре сантиметра дистальной илеи тонкой кишки. Вырезать и отбросить один сантиметр кишечника проксимальной к cecum.
Там будет три сантиметра часть илея слева, которые будут использоваться для сбора кишечных бактерий. Держите часть ileum над 2 миллилитровыми стерильными пробками. Соберите содержимое кишечника, непосредственно выдавлив кишечник и собирая образец в трубке.
Этот образец будет иметь бактерии из содержания илея. Приготовьте 20 миллилитровый шприц с холодным фосфатом буферного солевого раствора и промыть часть илея отбрасывая поток до конца. Поместите порцию илеума на стерильную чашку Петри и откройте ее продольно ножницами.
Очистите внутреннюю часть стенки илеума скальпелем. Соберите любые бактерии на скальпеле, стирая его с одним миллилитров PBS над чистой трубкой центрифуги. Спин на восемь тысяч раз G в течение пяти минут, чтобы гранулы бактерий.
После центрифугации отбрасывают супернатант. Этот образец будет содержать бактерии из стенки илеума. Взвесь трубки, содержащие образцы стула и илея.
Вычесть вес из пустых трубок, чтобы получить фекальный вес в каждом образце. Извлекайте бактериальную ДНК из стула, содержания илея и образцов стенок илея с использованием коммерчески доступных комплектов. Храните образцы ДНК при температуре минус 20 градусов по Цельсию до их использования.
Оттепель qPCR стандарт, фекальный образец ДНК и qPCR реагентов из коммерчески доступных комплект на льду. Разбавить стандарт в стерильной ДНК свободной воды в диапазоне от 10 до 7 до 10 до двух копий на микролитер. Разбавить фекальный образец ДНК до половины, одной пятой и одной десятой концентрации.
Затем сделайте мастер смесь реакции на общее количество реакций плюс один. Смешайте 30 микролитров мастер-микса и 5 микролитров шаблона, который является либо стандартом, образцом, либо водой для отрицательного контроля. Затем добавьте 10 микролитров этой смеси к каждой хорошо в 384 хорошо оптической пластины qPCR.
Выполните каждую реакцию в три раз. Печать пластины qPCR и центрифуги кратко. Затем загрузите пластину на машину qPCR, которая программирована как указанная в техническом протоколе.
Наконец, получить пороговые значения цикла для стандарта и образцов перед расчетом номеров копирования 16S rDNA для фекальных образцов. Репрезентативные результаты показывают потерю веса у мышей после введения антибиотиков пероральными гаважами или через питьевую воду. Нет заметной потери веса обнаруживается у мышей, которые получают антибиотики устные gavage.
Когда мышей лечат антибиотиками в питьевой воде они потерять около 10% от их веса тела в течение первых нескольких дней лечения, но восстановить нормальный прирост веса после этого. Количественная оценка бактерий в фекальных образцах требует использования стандартной кривой, полученной путем построения логаритма номера копии для стандарта по сравнению со значениями C-T, полученными в qPCR. В линейном диапазоне уравнение регрессионного анализа позволяет количественно оценить изобилие 16S rDNA в фекальных образцах.
Как показано здесь для стула, тонкой кишки содержание и тонкой кишки стенки образцов. После пяти или 10 дней перорального введения антибиотиков существует сильное снижение плотности бактерий в образцах стула от антибиотиков лечение мышей. Однако плотность бактерий в кале восстановилась до нормального уровня через неделю после того, как применение антибиотиков было остановлено.
Как устные gavage и введения антибиотиков в питьевой воде кратко уменьшить фекальные бактериальной нагрузки у обработанных мышей. Исследователи, которые выбирают индивидуальный метод, который лучше соответствует экспериментальным требованиям, учитывая такие факторы, как продолжительность лечения. Метод qPCR для количественной оценки бактерий может быть изменен для количественной оценки отдельных бактериальных такс с использованием конкретных грунтовок.
Это даст как количественную, так и квалитивную информацию о размере и составе микробиома.
Обзор
Этот протокол предоставляет надежный метод для определения изменений в кишечной микробиоте мышей после перорального введения антибиотиков. Он способствует исследованию взаимодействий микробиоты и патологий, связанных с микробным дисбалансом.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Нейробиология
- Фармакология
Фон
- Понимание влияния антибиотиков на микробиоту кишечника важно для изучения связанных заболеваний.
- Лечение антибиотиками может привести к микробному дисбалансу, влияя на общее состояние здоровья.
- Потеря веса является распространенным побочным эффектом введения антибиотиков мышам.
- Протоколы эффективного введения и мониторинга необходимы для получения точных результатов.
Цель исследования
- Разработать метод введения антибиотиков мышам без значительной потери веса.
- Собрать и проанализировать фекалии для количественного определения бактериальной ДНК.
- Исследовать влияние антибиотиков на состав микробиоты кишечника.
Используемые методы
- Приготовление антибиотических коктейлей для перорального введения или добавления в питьевой воды.
- Сбор фекалий и содержимого кишечника после эвтаназии.
- Извлечение ДНК из образцов с использованием коммерческих наборов.
- Количественное определение бактерий с помощью qPCR анализа.
Основные результаты
- Мышам, которым вводили антибиотики перорально, не наблюдалось значительной потери веса.
- Антибиотики в питьевой воде привели к первоначальной потере веса, но наблюдалось восстановление.
- Количественное определение бактериальной ДНК показало значительные изменения в составе микробиоты.
- Были установлены стандартные кривые для точного измерения изобилия 16S рДНК.
Выводы
- Протокол эффективно минимизировал потерю веса у мышей во время лечения антибиотиками.
- Он предоставляет надежный метод для исследования влияния антибиотиков на микробиоту кишечника.
- Результаты способствуют пониманию микробного дисбаланса и его последствий для здоровья.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This protocol enables reliable quantification of murine intestinal microbiota changes following oral antibiotic treatment, supporting preclinical studies of microbial dysbiosis linked to immunopathologies. By minimizing weight loss artifacts, it improves data interpretability for target validation in inflammation and immune-mediated disease models. The qPCR-based bacterial density assay provides quantitative, reproducible outputs essential for mechanistic de-risking and predictive confidence in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microbiota-immune crosstalk hypotheses in inflammatory bowel disease and arthritis models.
- Operational Value: Provides weight-stable antibiotic regimens that reduce confounding variables in target phenotype assessment.
- Predictive Value: Supports functional target validation by correlating microbial density shifts with immune cell functional readouts.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Delivers standardized fecal sample preparation and DNA extraction compatible with high-throughput qPCR platforms.
- Quantitative Output: Generates 16S rDNA copy number measurements via standard curves, enabling lot-to-lot consistency in microbiome modulation studies.
- Scalability: Supports longitudinal sampling designs for dose-response and time-course screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models antibiotic-induced dysbiosis observed in human patients, enhancing translational validity of preclinical findings.
- Mechanistic De-risking: Links microbial community changes to immune cell function, reducing ambiguity in pathway-target relationships.
- Preclinical Continuity: Enables longitudinal tracking of microbiota recovery post-treatment, informing safety and resistance risk assessments.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead optimization, providing microbiota modulation as a mechanistic variable in immunology and infectious disease programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of microbiota-dependent phenotypes in disease models via controlled antibiotic perturbation.
- Screening: Enables assay-ready microbiome samples for evaluating compound effects on bacterial load and composition.
- Analytics: Delivers quantitative 16S rDNA abundance data that allows cross-condition comparison and effect size calculation.
- Translational Research: Connects murine microbiota changes to human-relevant dysbiosis patterns, supporting biomarker-aligned study designs.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable microbiota quantification capability applicable across multiple therapeutic areas and model systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing weight-loss confounders in microbiota-immune studies.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized antibiotic cocktails and qPCR validation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing mechanistic links between microbial shifts and immune outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on microbiota-dependent disease relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine handling, oral gavage technique, and anaerobic sample processing.
- Depends on qPCR instrumentation, standard curve generation, and DNA extraction kit compatibility.
- Necessitates cross-team standardization for sample collection timing, storage, and normalization procedures.
- Involves adaptation considerations when extending to different mouse strains, antibiotic combinations, or intestinal segments.
- Includes practical limitations such as the need for euthanasia to access intestinal tissue and potential variability in fecal pellet yield.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:39
Administration of Antibiotics
2:29
Collection of Fecal Samples from Stool, Ileum Content and Ileum Wall
5:16
Quantification of Intestinal Microbiota by qPCR
6:33
Results: Quantification of Intestinal Microbiota by qPCR after Oral Antibiotic Treatment
7:51
Conclusion
