Петля опосредованной Assay изотермической амплификация (лампа) для быстрой идентификации Bemisia tabaci
29 октября 2018 г.
Этот документ сообщает протокол для быстрой идентификации assay для Bemisia tabaci на основе технологии цикла опосредованной изотермической амплификация (лампа). Протокол требует минимальной Лаборатория обучения и может таким образом, осуществляться на месте в пунктах въезда для растений импорта таких, как морские порты и аэропорты.
Этот метод обеспечивает быстрый и надежный диагностический инструмент для идентификации Bemisia tabaci, инвазивных насекомых-вредителей, влияющих на производство овощей и декоративных культур во многих странах мира. Благодаря своей простоте, метод может быть выполнен на месте непосредственно в пунктах въезда для растительной импортной продукции, таких как гавани и аэропорты, и тем самым имеет потенциал для сокращения разгона Bemisia tabaci вдоль торговых сетей. Для начала используйте ножницы, чтобы разрезать восьмитрубную полоску LAMP на две четырехтрубные полоски LAMP.
Затем отметь трубки по схеме, изложенной в рисунке одного из текстовых протоколов. После этого, подготовить достаточно B.tabaci LAMP реакции мастер смесь для 80 реакций. Затем раздайте 22,5 микролитров мастер-микса в каждую из трубок четырехтрубных полос LAMP.
Импульсная центрифуга, и положить их на лед. Быстрый вихрь и импульсная центрифуга B.tabaci LAMP PAC. Затем добавьте 2,5 микролитров в трубку с маркировкой PAC в каждой из четырехтрубных полос LAMP.
Затем закройте крышки и храните готовые к использованию комплекты B.tabaci LAMP при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Для начала извлечения ДНК используйте стерильные зубочистки для переноса образцов насекомых в 0,5-миллилитровые микроцентрифуги с 30 микролитров раствора для извлечения ДНК. Затем инкубировать образцы в течение пяти минут при 95 градусах по Цельсию в ThermoMixer установить до 300 об / мин.
Кратко вихрь и пульс центрифуги образцов. Оттепель один из готовых к использованию комплектов B.tabaci LAMP. Затем, вихрь комплект быстро, и пульс центрифуги его.
Добавьте 2,5 микролитров экстракта образцов ДНК в трубки S-one и S-two. Затем добавьте 2,5 микролитров чистого щелочного раствора для извлечения ДНК в трубку NAC. После вихревого и импульсного центрифугирования комплекта вставьте комплект в аналитическое устройство LAMP и проведем изотермальный анализ усиления ДНК при 65 градусах по Цельсию в течение 60 минут.
В том же запуске, выполнить анализ температуры плавления продуктов усиления ДНК, сначала нагревая комплект до 98 градусов по Цельсию и охлаждения его до 75 градусов по Цельсию. Проверка считывания LAMP с помощью автоматизированного приложения проверки LAMP. Во-первых, определите целевой вид и количество проверенных образцов, прежде чем нажать кнопку Generate Report.
Наконец, перенесите считывание в соответствующие области ввода приложения проверки. Сразу же после ввода данных будет отображаться результат проверки. В этом протоколе образцы насекомых B.tabaci, перехваченные в ходе регулярного швейцарского процесса контроля импорта, были проанализированы с помощью анализа LAMP.
Из 80 проанализированных образцов 75 образцов были правильно идентифицированы как истинные положительные стороны, а два образца были правильно идентифицированы как истинные негативы. Три образца, однако, были ложными негативами и были неправильно идентифицированы как не B.tabaci. Подмножество анализов было проведено на месте инспекторами по охране здоровья растений в аэропорту Цюриха.
В репрезентативных результатах образцы один и два были правильно идентифицированы как B.tabaci с помощью усиления ДНК примерно через 30 минут при ожидаемой температуре 82 градусов по Цельсию. После своего развития, этот метод проложил путь для быстрой и простой в работе на месте идентификации Bemisia табачи. Протокол разработан таким образом, что он может быть выполнен инспекторами по охране здоровья растений с ограниченной лабораторной подготовкой.
После успешной проверки метода на месте в швейцарском пункте въезда для растительной импортной продукции, метод может быть адаптирован к другим патогенным микроорганизмам растений, но и, при необходимости, к другим человеческим или ветеринарным патогенам.
Обзор
В данной работе представлен экспресс-метод идентификации Bemisia tabaci с использованием технологии петлевой изотермической амплификации (LAMP). Метод разработан для применения непосредственно в пунктах пропуска при импорте растений и требует минимальной лабораторной подготовки.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Патология растений
- Борьба с инвазивными видами
- Диагностические технологии
Обзор
- Bemisia tabaci является инвазивным насекомым-вредителем, поражающим сельскохозяйственные культуры по всему миру.
- Раннее обнаружение имеет решающее значение для предотвращения его распространения.
- Существующие методы могут быть непригодны для быстрого тестирования на месте.
- Технология LAMP предлагает перспективное решение для экспресс-диагностики.
Цель исследования
- Разработать быстрый и надежный метод идентификации Bemisia tabaci.
- Обеспечить возможность проведения тестирования непосредственно в пунктах импорта, таких как аэропорты и морские порты.
- Снизить риск распространения вредителя через торговые потоки.
Используемые методы
- Приготовление мастер-микса для реакции LAMP и экстракция ДНК.
- Изотермическая амплификация ДНК при 65 °C.
- Анализ температуры плавления продуктов амплификации.
- Валидация результатов с использованием автоматизированного приложения.
Основные результаты
- 75 из 80 образцов были правильно идентифицированы как истинно положительные.
- Два образца были правильно идентифицированы как истинно отрицательные.
- Три образца оказались ложноотрицательными.
- Метод был успешно валидирован инспекторами непосредственно на объекте.
Выводы
- Метод LAMP обеспечивает быстрый и эффективный способ идентификации вредителей.
- Его могут выполнять специалисты с ограниченным опытом лабораторной подготовки.
- Данный метод обладает потенциалом для адаптации к другим патогенам.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Быстрая молекулярная идентификация таких инвазивных вредителей, как Bemisia tabaci, имеет решающее значение для предотвращения сельскохозяйственных потерь и защиты глобальных цепочек поставок. Метод LAMP позволяет проводить обнаружение непосредственно в пунктах въезда, что снижает зависимость от централизованных лабораторий и сокращает время реагирования. Это способствует проактивному управлению рисками в области сельскохозяйственной биотехнологии и соблюдению правил международной торговли.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: обеспечивает специфическое обнаружение комплекса видов Bemisia tabaci, что способствует проверке гипотез в исследованиях взаимодействия переносчика и патогена.
- Практическая ценность: предоставляет стандартизированную молекулярную мишень для подтверждения компетентности насекомого-переносчика в доклинических моделях.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обеспечивает получение количественных сигналов амплификации в течение 60 минут, что позволяет проводить высокопроизводительный скрининг образцов насекомых.
- Практическая ценность: Требует минимального количества исходного материала и использует стабильные лиофилизированные реагенты, что обеспечивает масштабируемость анализа и возможность его применения в полевых условиях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Облегчает установление корреляции между наличием переносчика и риском передачи вируса в системах, имеющих значение для изучения заболевания.
- Практическая ценность: Обеспечивает возможность лонгитюдного мониторинга популяций вредителей в исследованиях в контролируемой среде.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный анализ встраивается в рабочие процессы раннего этапа поиска, обеспечивая быструю идентификацию переносчиков перед исследованиями передачи патогена, что позволяет обоснованно выбирать образцы для последующих анализов.
- Биология открытий: Подтверждает идентичность вектора для снижения количества ложных ассоциаций в экспериментах по взаимодействию вектора и вируса.
- Скрининг: Обеспечивает бинарный результат (положительный/отрицательный) с внутренним контролем, что гарантирует готовность анализа и воспроизводимость.
- Аналитика: Интегрируется с автоматизированным программным обеспечением для валидации, обеспечивая стандартизированную интерпретацию данных и согласованность результатов между разными лабораториями.
- Трансляционные исследования: Позволяет отслеживать распространенность вектора в географических регионах, подверженных угрозе появления новых растительных вирусов.
- Корпоративное повторное использование: Дизайн на основе наборов позволяет использовать метод на нескольких контрольных пунктах и адаптировать его для других видов векторов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность определения целевых объектов за счет сокращения случаев ошибочной идентификации насекомых-переносчиков в биологических исследованиях.
- Практическая ценность: Устраняет необходимость в очистке ДНК и термоциклировании, снижая технический порог и требования к подготовке персонала.
- Стратегическая ценность: Ускоряет принятие решений о целесообразности дальнейших действий при оценке рисков, связанных с вредителями, что снижает потенциальные потери урожая и экономический ущерб.
- Влияние на портфель проектов: Обеспечивает приоритезацию ресурсов для эпизоотологического надзора с учетом рисков на основе подтвержденных данных об обнаружении переносчиков.
Особенности внедрения
- Базовая подготовка по молекулярной биологии по работе с реагентами и подготовке проб.
- Доступ к прибору для детекции флуоресценции или мутности, поддерживающему метод LAMP.
- Стандартные операционные процедуры по транспортировке образцов и контролю загрязнения.
- Особенности адаптации метода для различных видов насекомых или стадий развития.
- Стабильность реагентов в условиях окружающей среды при развертывании в полевых условиях и хранении.
