Сочетая гистохимические окрашивание и анализа изображений для количественного определения крахмала в яичнике Примордия черешни во время зимней спячки

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о спячке в древесных растений, например, почему цветочные почки должны накапливаться холодно в зимний период, чтобы цветок правильно. Основным преимуществом этой техники является то, что она позволяет количественно оценить крахмал в очень небольших образцах цветочного первобытного. Этот подход очень полезен для обнаружения физиологической активности цветка изначальная во время покоя, а также может быть применен к другим видам деревьев, как абрикос или слива.

Хотя этот метод может дать представление о спящем зародыше цветка, он также может быть применен к другим процессам, таким как репродуктивная фаза от опыления до начала плодоносения. Для начала соберите пять побегов с поля. Затем взвесьте и зафиксйте 10 цветочных почек в 10-миллилитровой стеклянной трубке с фиксаторным раствором не менее 24 часов при четырех градусах Цельсия.

После этого отбросьте фиксатор и добавьте достаточно 75% этанола, чтобы покрыть образцы. Получить три побега, которые от 15 до 30 сантиметров в длину и пять миллиметров в диаметре с 10 цветочных почек каждый. Затем поместите побеги на пропитанную водой пену флориста в камеру роста.

После 10 дней в камере роста, удалить цветочные почки из побегов и взвесить их. Каждую неделю с начала осени до бутонов весной, оцените рост цветочных почек. Удалите внешние весы бутонов из каждого образца, а затем поместите каждый бутон в стакан часовщика, содержащий 75% этанола.

Используйте высокоточные типсы и офтальмологические скальпель, чтобы вскрыть почки и получить по крайней мере один цветок изначальный из каждого бутона. Вставь образцы индивидуально в парафиновый воск, чтобы сформировать блок и разделить их на роторный микротом. Разделив образцы, нанесите на секцию каплю свежего йода Лугола.

Через пять минут удалите лишнее пятно с помощью бумаги. Затем нанесите небольшую каплю синтетических монтажных средств массовой информации, поместите небольшое стекло крышки над образцом, и нажмите трудно. После того, как монтажные средства массовой информации высохнут, наблюдайте за окрашенным сечением под ярким микроскопом.

Сначала отрегулируйте диафрагму диафрагмы и контроль яркости в соответствии с текстовым протоколом. Затем убедитесь, что в держателе фильтра нет фильтров, и выберите в микроскопе состояние яркого поля. После этого отрегулируйте настройки камеры для окрашенной подготовки без ткани.

Исправить яркость на 50%Следующий активировать функцию передержки / недоэкспозиции и настроить время экспозиции на пределе передержки. Нанесите функцию баланса белого и коррекцию затенения. Измерьте серый уровень полученного черно-белого изображения окрашенного препарата без ткани.

Затем нанесите 4N-фильтр, приобрети еще одно черно-белое изображение препарата и измерьте серый уровень. Затем приобрети изображение той же подготовки без света и измерьте серый уровень полученного изображения и откалибровайте. После этого приобрети цветное изображение образца секции в формате TIFF с разрешением не менее 300 dpi.

Создайте двоичное изображение, соответствующее окрашенной области, а затем установите три цветовых порога до тех пор, пока двоичное изображение точно не отражат окрашенные гранулы крахмала. Повторите этот процесс с другими препаратами и тканями, чтобы точно настроить окончательные уровни обнаружения. Используя систему анализа изображений, измерьте сумму оптической плотности каждого пикселя под маской для количественной оценки содержания крахмала в полевых условиях.

В этом протоколе, рост цветочных почек и состояние покоя были оценены путем измерения увеличения веса бутона после 10 дней в подходящих условиях. Во время спячки, никаких изменений не наблюдалось после 10 дней в подходящих условиях. После того, как спячка была преодолена, почки опухли и ворвались в камеру роста.

Содержание крахмала в изначечном изначе было количественно с помощью анализа изображений в каждом микротомном разделе. Последовательно, количество крахмала в начале зимы представил оптической плотности значение менее 40000 и максимальное количество достигло значения между 120000 и 140000 в течение обоих лет исследования. Принимая во внимание спячку, максимальное количество крахмала произошло одновременно с охлаждением выполнения в течение обоих лет.

Важно помнить, что уровни обнаружения, используемые анализатором изображений, напрямую зависят от калибровки системы. Это включает в себя состояние света, интенсивность пятен, и увеличение микроскопа. Это условие должно быть исправлено для всех препаратов.

Сочетание гистохимических методов с анализом изображений привело к очень полезно изучить углеводный резерв цветка изначалия в различных фазах покоя. Он также может быть применен к другим видам и тканям. Взаимосвязь между высвобождением покоя и накоплением крахмала в имордии яичников, о чем говорится в использовании этого метода, обеспечивает хорошую основу для понимания биологической основы покоя и пугающих потребностей.

Будущие усилия должны быть сосредоточены на изучении надежных биологических показателей, которые могли бы легко указать состояние покоя дерева. Между тем, картина вариаций крахмала вдоль покоя может быть использована для кадра дальнейших физиологических и генетических исследований.