Очищение сродства хлоропласта Translocon белковых комплексов с помощью тега крана

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области хлоропласта, например, состав хлоропласта белка импортного оборудования. Это имеет важное значение для озеленения и фотосинтеза и, следовательно, для производства продуктов питания на планете. Молекулярная машина состоит из двух отдельных комплексов во внешнем и внутреннем члене хлоропласта под названием TOC и TIC, но состав не до конца известен.

Основным преимуществом этой техники является то, что очистка комплекса Arabidopsis TOC/TIC может быть выполнена в одном шаге метода очистки, TAP-TOC очистки. Это специфический и эффективный метод. Как правило, исследователи, новые для этого метода могут бороться, потому что они не знакомы с изоляцией хлоропласт мембранных фракций, моющих средств, solubilization, или сродства очистки.

После приготовления растений арабидопсиса, измельчить 10 граммов трехнедельной саженцев в жидком азоте, используя холодный раствор и пестик с песком. Добавьте 20 миллилитров холодного шлифовального буфера в наземные ткани. Хорошо перемешать и дать смеси оттаять на льду.

Затем замочите два слоя материала быстрой фильтрации с шлифовальным буфером. Фильтр гомогената через два слоя фильтрационного материала в 50 миллилитров конической центрифуги трубки. Центрифуга фильтрата на 1500 раз g в четыре градуса по Цельсию в течение 10 минут и передать супернатант в свежий, предварительно охлажденный 50 миллилитров конической центрифуги трубки.

Повторите центрифугу еще раз при тех же условиях. Перенесите супернатант в холодную 38,50 миллилитровую ультрацентрифугную трубку и дополните ее до 35 миллилитров с холодным шлифовальным буфером. Используйте ультрацентрифуг для центрифуги образца в 100 000 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение одного часа.

Используя стеклянный тефлоновый гомогенизатор, повторно посовещь зеленые гранулы в шлифовальный буфер. Центрифуга при 100 000 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение одного часа и отбросить супернатант. Используйте стеклянный тефлоновый гомогенизатор для повторного использования зеленой гранулы в 18,75 миллилитров одного буфера шлифования x.

Затем добавьте еще 9,375 миллилитров одного х шлифовального буфера. Добавьте 9,375 миллилитров из четырех растворов раствора для раствора до 37,5 миллилитров и инкубировать на вращающемся шейкере при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут. После этого используйте ультрацентрифуг для центрифуги образца в 100 000 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение одного часа.

Перенесите супернатант, содержащий солубилизованные мембраны, в свежую 50-миллилитровую коническую центрифугу. После подготовки смолы агарозы IGG, перенесите ранее промытую смолу агарозы IGG в 50 миллилитровую коническую трубку, содержащую 37,5 миллилитров солубилизованных мембран. Инкубировать в течение ночи на вращающийся шейкер при четырех градусах по Цельсию.

На следующий день осадок смолы агарозы IGG в 100 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут. Используйте пипетку, чтобы удалить супернатант. Была смола агарозы IGG в 37,5 миллилитров буфера А и инкубировать на вращающемся шейкере при комнатной температуре в течение 10 минут.

Продолжить осадочные и промывки смолы, как указано в текстовом протоколе. После этого перенесите смолу агарозы IGG в колонку спина 500 микролитров с фильтром 35 микрон. Вымойте бисер дважды с 300 микролитров буфера TEV elution для эквилибрации.

Далее добавьте 300 микролитров буфера TEV elution, содержащих 10 микролитров протеазы TEV. Инкубировать спин колонку с бисером в Thermomixer при 16 градусов по Цельсию и 350 об / мин в течение двух часов. Затем откройте колонку спина и поместите ее в новую, чистую, 1,5 миллилитровую трубку.

Спин этой трубки в 100 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут, чтобы собрать элуат. В этом исследовании TAP помечены хлоропласт конверт белковый комплекс из трансгенных растений A.thaliana очищается. Иммунобло анализ подтверждает, что изолировать TAP-TOC159 взаимодействует с TOC75 и TOC33 комплекса TOC.

Хлоропласт внешней мембраны киназы, KOC1, который, как известно, фосфорилат TOC159 также совместно изолированы. Наличие TIC110 показывает, что изолированный комплекс TAP-TOC159 также содержит компоненты комплекса ТИК. Антитела FBN1A не распознали комплекс TAP-TOC159, что указывает на отсутствие загрязнений.

В отрицательном контроле, иммунопрофилированный белок NTAP не соизолировался ни с одним из белков TOC, TIC и подтверждает специфику очистки TAP-TOC159. Хотя этот метод может обеспечить понимание импорта белка хлоропласта, он потенциально может быть применен к любому другому комплексу в системе бутылки Arabidopsis thaliana. После этой процедуры могут применяться и другие методы, такие как западная блоттинг или масс-спектрометрия, чтобы продемонстрировать наличие известных компонентов или определить новые компоненты комплексов TOC и TIC.

Этот метод проложил путь для исследований в области импорта хлоропласта для изучения функции новых компонентов комплексов TOC и TIC.