Очищение сродства хлоропласта Translocon белковых комплексов с помощью тега крана
1 ноября 2018 г.
Здесь мы представляем проверенных и протестированных протокол для очистки хлоропласта импорта комплексы протеина (TOC TIC комплекс) с помощью крана тега. Близость изоляции протокол одношаговый потенциально может быть применен к любой белок и использоваться для выявления новых взаимодействия партнеров по масс-спектрометрии.
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области хлоропласта, например, состав хлоропласта белка импортного оборудования. Это имеет важное значение для озеленения и фотосинтеза и, следовательно, для производства продуктов питания на планете. Молекулярная машина состоит из двух отдельных комплексов во внешнем и внутреннем члене хлоропласта под названием TOC и TIC, но состав не до конца известен.
Основным преимуществом этой техники является то, что очистка комплекса Arabidopsis TOC/TIC может быть выполнена в одном шаге метода очистки, TAP-TOC очистки. Это специфический и эффективный метод. Как правило, исследователи, новые для этого метода могут бороться, потому что они не знакомы с изоляцией хлоропласт мембранных фракций, моющих средств, solubilization, или сродства очистки.
После приготовления растений арабидопсиса, измельчить 10 граммов трехнедельной саженцев в жидком азоте, используя холодный раствор и пестик с песком. Добавьте 20 миллилитров холодного шлифовального буфера в наземные ткани. Хорошо перемешать и дать смеси оттаять на льду.
Затем замочите два слоя материала быстрой фильтрации с шлифовальным буфером. Фильтр гомогената через два слоя фильтрационного материала в 50 миллилитров конической центрифуги трубки. Центрифуга фильтрата на 1500 раз g в четыре градуса по Цельсию в течение 10 минут и передать супернатант в свежий, предварительно охлажденный 50 миллилитров конической центрифуги трубки.
Повторите центрифугу еще раз при тех же условиях. Перенесите супернатант в холодную 38,50 миллилитровую ультрацентрифугную трубку и дополните ее до 35 миллилитров с холодным шлифовальным буфером. Используйте ультрацентрифуг для центрифуги образца в 100 000 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение одного часа.
Используя стеклянный тефлоновый гомогенизатор, повторно посовещь зеленые гранулы в шлифовальный буфер. Центрифуга при 100 000 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение одного часа и отбросить супернатант. Используйте стеклянный тефлоновый гомогенизатор для повторного использования зеленой гранулы в 18,75 миллилитров одного буфера шлифования x.
Затем добавьте еще 9,375 миллилитров одного х шлифовального буфера. Добавьте 9,375 миллилитров из четырех растворов раствора для раствора до 37,5 миллилитров и инкубировать на вращающемся шейкере при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут. После этого используйте ультрацентрифуг для центрифуги образца в 100 000 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение одного часа.
Перенесите супернатант, содержащий солубилизованные мембраны, в свежую 50-миллилитровую коническую центрифугу. После подготовки смолы агарозы IGG, перенесите ранее промытую смолу агарозы IGG в 50 миллилитровую коническую трубку, содержащую 37,5 миллилитров солубилизованных мембран. Инкубировать в течение ночи на вращающийся шейкер при четырех градусах по Цельсию.
На следующий день осадок смолы агарозы IGG в 100 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут. Используйте пипетку, чтобы удалить супернатант. Была смола агарозы IGG в 37,5 миллилитров буфера А и инкубировать на вращающемся шейкере при комнатной температуре в течение 10 минут.
Продолжить осадочные и промывки смолы, как указано в текстовом протоколе. После этого перенесите смолу агарозы IGG в колонку спина 500 микролитров с фильтром 35 микрон. Вымойте бисер дважды с 300 микролитров буфера TEV elution для эквилибрации.
Далее добавьте 300 микролитров буфера TEV elution, содержащих 10 микролитров протеазы TEV. Инкубировать спин колонку с бисером в Thermomixer при 16 градусов по Цельсию и 350 об / мин в течение двух часов. Затем откройте колонку спина и поместите ее в новую, чистую, 1,5 миллилитровую трубку.
Спин этой трубки в 100 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут, чтобы собрать элуат. В этом исследовании TAP помечены хлоропласт конверт белковый комплекс из трансгенных растений A.thaliana очищается. Иммунобло анализ подтверждает, что изолировать TAP-TOC159 взаимодействует с TOC75 и TOC33 комплекса TOC.
Хлоропласт внешней мембраны киназы, KOC1, который, как известно, фосфорилат TOC159 также совместно изолированы. Наличие TIC110 показывает, что изолированный комплекс TAP-TOC159 также содержит компоненты комплекса ТИК. Антитела FBN1A не распознали комплекс TAP-TOC159, что указывает на отсутствие загрязнений.
В отрицательном контроле, иммунопрофилированный белок NTAP не соизолировался ни с одним из белков TOC, TIC и подтверждает специфику очистки TAP-TOC159. Хотя этот метод может обеспечить понимание импорта белка хлоропласта, он потенциально может быть применен к любому другому комплексу в системе бутылки Arabidopsis thaliana. После этой процедуры могут применяться и другие методы, такие как западная блоттинг или масс-спектрометрия, чтобы продемонстрировать наличие известных компонентов или определить новые компоненты комплексов TOC и TIC.
Этот метод проложил путь для исследований в области импорта хлоропласта для изучения функции новых компонентов комплексов TOC и TIC.
Обзор
В данной статье представлен одношаговый протокол аффинной изоляции для очистки белковых импортных комплексов хлоропластов (комплекс TOC-TIC) с использованием TAP-тега. Этот метод может выявить новых партнеров по взаимодействию с помощью масс-спектрометрии и является важным для понимания функции хлоропластов.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Биология хлоропластов
- Очистка белков
- Масс-спектрометрия
Фон
- Механизм импорта белков в хлоропласты необходим для фотосинтеза и производства пищи.
- Комплексы TOC и TIC участвуют в импорте белков, но их полный состав не до конца изучен.
- Существующие методы изоляции этих комплексов могут быть сложными и трудоемкими.
- Это исследование направлено на упрощение процесса очистки.
Цель исследования
- Разработать простой протокол для очистки комплекса TOC-TIC.
- Облегчить идентификацию новых компонентов, участвующих в импорте белков в хлоропласты.
- Предоставить метод, который можно применять к другим белковым комплексам в Arabidopsis thaliana.
Используемые методы
- Подготовка сеянцев Arabidopsis и измельчение в жидком азоте.
- Последовательная центрифугация для изоляции мембран хлоропластов.
- Аффинная очистка с использованием агаразовой смолы IGG.
- Иммуноблот-анализ для подтверждения наличия специфических белков.
Основные результаты
- Комплекс TAP-TOC159 был успешно очищен и показано, что он взаимодействует с TOC75 и TOC33.
- Совместная изоляция TIC110 указывает на наличие компонентов TIC в очищенном комплексе.
- Метод продемонстрировал специфичность, так как отрицательные контроли не показали совместной изоляции с белками TOC и TIC.
- Эта техника позволяет дальнейшее исследование механизмов импорта белков в хлоропласты.
Выводы
- Метод очистки с использованием TAP-тега является эффективным и специфичным для изоляции белковых комплексов хлоропластов.
- Этот подход может улучшить исследования системы импорта белков в хлоропласты.
- В будущих исследованиях можно использовать этот метод для выявления новых компонентов комплексов TOC и TIC.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Understanding the composition of chloroplast protein import complexes is critical for advancing plant biotechnology and improving crop yield. The TAP-TOC159 purification method enables efficient isolation of membrane protein complexes, supporting target validation and mechanistic de-risking in chloroplast-related research. This approach enhances predictive confidence in identifying novel components of the TOC and TIC complexes, with implications for synthetic biology and metabolic engineering in biopharma-relevant plant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of the chloroplast protein import machinery by isolating TOC159-containing complexes for functional analysis.
- Operational Value: Provides a specific and efficient one-step purification strategy that reduces experimental variability in complex isolation.
- Strategic Value: Supports hypothesis-driven target validation by confirming interactions with known components like TOC75, TOC33, TIC110, and KOC1.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified complexes suitable for downstream applications such as mass spectrometry to identify novel interactors.
- Operational Value: Produces reproducible isolations amenable to standardized workflows for complex profiling.
- Strategic Value: Facilitates assay readiness by delivering enriched complexes that improve detection sensitivity in screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains complex integrity through gentle TEV protease elution, preserving native interactions for functional follow-up.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to validation by providing material suitable for immunoblot and mass spectrometry analysis.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement by confirming specificity through negative controls, reducing false-positive risks.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase, enabling isolation of native complexes to inform target identification and pathway elucidation before progressing to functional assays or engineering efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating TOC-TIC complexes to study protein import mechanisms.
- Screening: Delivers solubilized membrane complexes that are amenable to affinity capture and downstream analytical readouts.
- Analytics: Enables quantitative and qualitative analysis via immunoblot and mass spectrometry to compare complex composition across conditions.
- Translational Research: Connects discovery to validation by providing biochemically defined complexes that reflect native chloroplast membrane environments.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable affinity purification platform applicable to other membrane-bound complexes in Arabidopsis thaliana.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by enabling specific isolation of TOC159-associated complexes.
- Operational Value: Improves reproducibility through standardized affinity purification and gentle elution conditions.
- Strategic Value: Enhances decision-making by providing reliable data on complex composition to guide target prioritization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted investment in chloroplast-targeted traits by de-risking target identification through specific complex isolation.
Implementation Considerations
- Expertise in chloroplast membrane isolation and detergent-based solubilization is required.
- Access to ultracentrifugation equipment and affinity resins (IgG agarose) is necessary for membrane preparation and complex capture.
- Standardization of washing and elution conditions across labs is critical to ensure reproducibility of complex isolation.
- Adaptation to other model systems may require optimization of tag accessibility and complex stability.
- Practical limitations include the need for transgenic lines expressing TAP-tagged constructs and potential tag interference with native function.
