Измерения взаимодействий шаровых и волокнистых белков спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и микромасштабной Thermophoresis (MST)

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области взаимодействия белка, такие как ли белок связывается с небольшой или большой молекулы непосредственно. Основным преимуществом этого метода является то, что это простой и быстрый способ обнаружения прямых взаимодействий на атомном уровне. Включите воздушный поток с командой выброса ej.

Это принесет образец из магнита. Теперь поместите образец в спиннер поверх магнита в отверстие. Вставьте с командой ij.

Подождите, пока образец оседает внутри магнита, прежде чем продолжить. Создайте новый набор данных с использованием команд edc и загрузите стандартные параметры протонного NMR, выбрав эксперимент zGPR. Заполните NAME, номер эксперимента и обработанные поля числа папок данных.

Выберите растворитель в поле растворителя Set и нажмите на Execute getprosol, чтобы прочитать стандартные параметры, зависящие от зонда и растворителя. Заблокив образец на дейтетерированный растворитель с помощью команды блокировки и ждать, пока он не закончит радикальные и достигает блокировки. Исправь резонансную частоту магнита, намагничив образец с помощью автоматической команды настройки атмы.

Мониторинг кривой колебания до тех пор, пока автоматическая настройка не будет завершена. Shim магнитного поля с помощью топшима. Shimming вносит коррективы в магнитное поле.

Достичь единообразия вокруг образца. Это хорошая практика, чтобы хранить это в значениях с командой wsh, и читать их с помощью rsh до topshim, если с помощью тех же или аналогичных образцов. Теперь отрегулируйте усиление приемника с командой rga для достижения максимального соотношения сигнала к шуму.

Поместите центр спектра на смещение резонанса воды и установите 90-градусный протонный импульс на высокую мощность с помощью calibo1p1. Соберите протонный спектр с помощью команды zero go zg и обработать efp. Это включает в себя экспоненциальное умножение, свободный распад индукции, включающий расширение линии, преобразование Fourier FID и pk для применения фазовой коррекции.

Применить автоматическую коррекцию фазы apk и автоматической базовой коррекции absn с помощью полиномиальной без интеграции вариант. Создайте новый набор данных для эксперимента SOFAST HMBC, выбрав в эксперименте SFHM-C3GPPH. Копировать оптимизированные P1 и O1 из протонного спектра и заполнить P1 зависимых импульсов с помощью команды getprosol 1H p1 plw1, где p1 является оптимизированным значением P1, и plw1 является уровнем мощности для P1. Теперь оптимизируйте константу CNST54, чтобы установить смещение для химического сдвига.

Также оптимизируйте CNST55 для определения пропускной способности, чтобы охватить спектральные области интереса, что позволяет оптимизировать прирост приемника. Чтобы выбрать эти параметры, извлекайте первый FID из двумерного спектра и ищите наблюдаемый сигнал для их определения. Кроме того, варьировать задержку релаксации, количество сканирований, и манекен сканирования для получения приемлемой чувствительности сигнала с командой gs, что позволяет идти и сканировать для мониторинга качества данных в режиме реального времени.

Наконец, завехайте спектры с помощью нулевого Go zg. Установите параметры обработки до размера прямых размеров F2 и косвенных размеров F1 спектра с дополнительным линейным прогнозом в косвенном измерении. Выберите «SINE» в качестве функции окна и введите сдвиг колокола Sine из двух для обработки двумерного спектра.

Введите команду xfb для обработки данных в обоих направлениях с функцией окна и преобразованием Fourier. Используйте команду apk2d для автоматической коррекции фазы в обоих направлениях. Исправь базовый уровень с помощью функции автоматической базовой коррекции abs2 для 2D-данных.

Это применяется полиномиальная функция между значениями ppm, определенными в параметрах обработки, и будет производить 2D спектр для дальнейшего анализа. Планируя выполнить серийную обработку для сравнения данных взаимодействия с другой молекулой, храните параметры обработки с командой wpar и вспомните их с помощью rpar. Введите командное pp, чтобы начать процесс пикового выбора.

Определите диапазон ppm, минимальную интенсивность и максимальное количество пиков на основе ожидаемых пиков. Тогда нажмите OK. Проверить результаты с помощью визуального осмотра. При необходимости повторно запустите процесс до тех пор, пока результаты не будут удовлетворительными на основе качества спектра.

Создать пиковый список с командой pp. Этот пиковый список содержит информацию о высоте данных и пиковой интенсивности по умолчанию. Пиковый список может быть экспортирован в последующие спектры и может быть прочитан другими программами.

Теперь наблюдайте за спектрами белка HS'C для изменений пиковой интенсивности или движения в химических сдвигах, которые указывают на взаимодействие с другой молекулой. Если взаимодействующая молекула большая, ожидайте снижения пиковой интенсивности наряду с исчезновением некоторых пиков. Импорт пиковый список к следующему набору данных, нажав на вкладку пиков и выбрав импорт с правой кнопкой мыши в окне пиков.

Визуализуйте пики спектра и при необходимости переведайте их на новые позиции. Нажмите на кнопку сброса интенсивности для полной таблицы для создания пикового списка для спектра, который включает в себя интенсивности. Этот пиковый список будет переносить информацию о позиции из сохраненного пикового списка.

Экспорт пиковых списков из различных наборов данных в электронную таблицу или другую математическую программу для анализа путем выбора функции экспорта. Рассчитайте изменение пиковой интенсивности с функцией пиковой интенсивности в сложном спектре, пиковой интенсивности в спектре белка для каждого пика. Значения могут быть преобразованы в процентное изменение путем умножения на 100.

Обратите внимание, что пиковые объемы также полезны, хотя пик интенсивности легче измерить для пиков, которые расположены близко друг к другу, как это обычно бывает для белков с высокой плотностью относительно широких пиков. N15HS-C были приобретены для дикого типа E-PRD, а также R1914E мутант, в присутствии или отсутствии VimRod. Спектр дикого типа E-PRD показывает ожидаемое количество хорошо разрешенных пиков, что свидетельствует о правильно сложенном белке.

В присутствии VimRod спектр показывает обширное расширение линии и пиковое исчезновение, что соответствует связыванию между E-PRD и VimRod. Мало что изменилось между спектром R1914E мутант сам по себе и при добавлении VimRod, что свидетельствует об отсутствии привязки к этому мутанту E-PRD. Здесь пик E-PRD интенсивности в присутствии и отсутствии VimRod были сравнены и построены как относительные интенсивности пика, чтобы указать диапазон пикового расширения в комплексе E-PRD.

Для проверки и количественной оценки связывания VimRod и E-PRD, анализ MST с использованием His6-VimRod помечены флуоресцентные RED-tris-NTA красителя в качестве цели, был выполнен с использованием снижения концентрации E-PRD лиганд. Данные соответствовали стандартной модели однокоурового связывания лиганда и давали KD 25,7 плюс-минус 2,1 микромолара. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы использовать идентичные условия приобретения и обработки.

будет бороться из-за доступа к изотопным помеченным образцам белка для сбора спектров ЯМР. Последствия этого метода распространяются на терапию рака, инфекции или нейродегенеративных заболеваний, поскольку они включают в себя формирование белковых взаимодействий, которые скомпрометированы в болезни.