Цифровой анализ иммуностоинга взаимодействующих белков в тканях легких человека

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в патологических и иммуногистохимии. Основным преимуществом этой техники является то, что достаточно быстро и что производит цифровые средства массовой информации с высоким качеством. Начните с фиксации образца кунг-ткани размером три на три сантиметра в 4%paraformaldehyde в течение 24 часов при комнатной температуре.

На следующий день обезвоживать ткани в восходящих погружений этанола при комнатной температуре, а затем три погружения в 100% ксилена в течение 20 минут за лечение. После последнего погружения ксилена поместите ткань в парафин 63 градусов по Цельсию в течение 30 минут, а затем второе 45-минутное погружение в свежий 63-градусный парафин по Цельсию, а затем изменить парафин еще раз для окончательного один час инкубации. Когда парафин остынет, используйте роторный микротом, чтобы приобрести пять микрометров толщиной разделов парафин-встроенный образец ткани, захватив разделы на 20 микрограмм на миллилитр поли-L-лизин покрытием слайдов.

Для dewaxing, поместите слайды в 65-градусной печи по Цельсию в течение двух часов, а затем погружение в диметилбензен в течение 15 минут и замачивания в 100% ксилена в течение 15 минут, а затем регидратации слайдов в нисходящем этанола погружения серии. Для ремонта антигена поместите горки в антиген-ремонтную коробку и добавьте в коробку 300 миллилитров лимонной кислоты. Нагрейте коробку в микроволновой печи на высокой мощности в течение двух минут, а затем нагрева при низкой мощности для поддержания кипения в течение шести минут.

Когда горки остыли до комнатной температуры, мыть образцы тканей с тремя пятиминутными 0,01 молара PBS моет в роторный шейкер при комнатной температуре. Чтобы устранить эндогенную пероксидаза, инкубировать слайды с 3%перекисью водорода в двойной дистиллированной воде в течение 30 минут во влажной коробке при комнатной температуре. В конце инкубации, мыть слайды, как попродемонстрировано, и подключить любые неспецифические связывания на каждом разделе с 100 микролитров 10%goat сыворотки в течение 39 минут при 37 градусов по Цельсию.

Далее, этикетка тканей с 100 микролитров анти-ЗВИНТ антитела на слайде на четыре градуса цельсия в одночасье, а затем три моет в 0,01 молар PBS. После последней стирки, инкубировать слайды с соответствующим вторичным антителом в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию, а затем три 0,01 молярных PBS моет. После последней стирки добавьте горки до 300 микролитров свежего DAB в течение 10 минут, а затем 10-секундную стирку водопроводной водой при комнатной температуре.

Счетчики окрашивают ткани раствором гематоксилина в течение двух минут при комнатной температуре, затем мыть в водопроводной воде в течение 15 минут, затем снова обезвоживают ткани в восходящих погружениях этанола, а затем два 15-минутных погружения в ксилен при комнатной температуре. После последнего погружения 100% этанола, смонтировать разделы с 15 микролитров 5%xylene в нейтральном растворе десен и покрыть каждый образец ткани с крышкой стекла. Для автоматического сканирования целых слайдов секций, сначала позвольте слайды высохнуть при комнатной температуре в течение 12 часов, чтобы высушить образцы тканей.

Далее, в автоматическом сканере всего слайда, выберите Brightfield вручную и введите интерфейс ручного сканирования. Пересмотрите название слайдов и выберите путь хранения изображений. Установите область сканирования и выберите образцы сканирования с помощью опции Пороги пользователя-Set.

Порог составляет около 50 с расширением области сканирования значение 200 микрометров. Установите значение фокусировки сканирования и выберите режим автоматического фокусировки и одного слоя, затем загрузите слайды на рабочую станцию и начните автоматическое сканирование. Когда все слайды будут отсканированы, сохраните изображения для более длительного анализа.

Для анализа изображений секций легочной ткани откройте гистопатологическое программное обеспечение для анализа изображений и выберите местный компьютер, чтобы открыть файл с данными сканирования. Выберите соответствующий уровень масштабирования и используйте Toggle Color Adjust, чтобы установить цвет до оптимального контраста, затем обвямите и назовите области интереса на каждом изображении. Далее, под плагинами, выберите КК. Строитель сценариев всплывает.

Выберите Квант плотности и отрегулируйте планку обнаружения. Отрегулируйте уровни оценки до тех пор, пока интенсивность окрашивания обведенных областей не будет похожа на интенсивность исходных изображений, а также храните и ими название модели в качестве нового файла, затем примените модель к другим слайдам и выберите выбранную аннотацию, чтобы программное обеспечение автоматически вычисляет оценку APE для областей, представляющих интерес для каждого изображения. Все-слайд цифрового сканирования легочной ткани разделов опухоли и прилегающих неохо опухолевых тканей из не-малых клеток рака легких образцов производит цифровые изображения высокого качества.

Оценки APE, рассчитанные из этих типов образцов рака легких, как правило, значительно выше, чем те, которые определены для соседних неохоковой ткани. Кроме того, уровни экспрессии ЗВИДТ в секциях плоскоклеточной карциномной ткани часто определяются как значительно более высокие, чем уровни, измеренные в образцах абнокарциномной ткани. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы подготовить с высоким качеством опухоли или опухолевых областей во время принятия патологического сканирования.

После этой процедуры, другие методы микроскопии могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы. Ни другой метод патологического сканирования. После этого техника проложила путь для исследователей в области патологического сканирования для изучения цифровой диагностики в исследовательской цели.

Не забывайте, что работа с параформальдегидом может быть чрезвычайно опасной и такие меры предосторожности, как маски всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.