В пробирке Метод для контроля концентрации галогенированные газов в культивированный альвеолярных клеток эпителия
23 октября 2018 г.
Мы опишем простой протокол, специально разработан для достижения точный и контролируемый концентраций севофлурана или изофлюрановая в пробирке для того, чтобы улучшить наше понимание механизмов, участвующих в повреждения эпителия легких и проверить Роман лечение острого респираторного дистресс-синдрома.
Этот метод может помочь ответить на ключевой вопрос в области исследований травмы легких и ремонта, таких как тестирование галогенированных адъюнкт в качестве потенциальных новых методов лечения острого респираторного дистресс-синдрома. Основным преимуществом этого метода является то, что он опирается на очень простой метод культуры клеток и подвергать их галогенированных агентов для того, чтобы достичь точных и контролируемых концентраций. Для построения герметичной камеры используйте герметичную полипропиленовую коробку емкостью 6,5 литра.
Просверлите отверстие диаметром 2,5 сантиметра на нижней стороне боковой стенки коробки. Затем вставьте гофрированную трубку с зеленой меткой, которая будет служить в качестве газовой воздушной смеси входной трубы. И запечатать его силиконом.
Затем просверлите второе отверстие диаметром 2,5 сантиметра на верхней стороне противоположной боковой стены. Вставьте еще одну гофрированную трубку с красной меткой и соедините ее с угольным фильтром, который будет служить в качестве трубы выхода газовой смеси воздуха. Затем запечатай его силиконом.
Впоследствии просверлите плотное отверстие диаметром четыре миллиметра в центре стены. Вставьте короткую настойную трубку, которая соединена при многообразии с вращающимся мужским замком приманки. Подключите его к газоаанализу и запечатай с силиконом.
Затем поместите цифровой термометр в герметичную камеру. Под капотом лабораторного экстрактора наймите анестезиатичную схему машины для переключения газовой линии закиси азота на углекислый газ. Вставьте нагретый увлажнитель в трубу между обезболивающей машиной и герметичной камерой, чтобы согреть смесь потока газа примерно до 37 градусов по Цельсию.
Подключите герметичную камеру с зеленой отмеченной гофрированной трубкой в настраиваемую анестезиальную схему машины. Затем поместите герметичную камеру на горячую пластину, установленную до 37 градусов по Цельсию. Поместите шесть хорошо пластины, содержащие человека альвеолярных эпителиальных клеток в герметичной камере и запечатать крышку.
Регулировать скорость потока газа, чтобы быстро получить 5% CO2. Затем откройте галогенированный испаритель агента и отрегулируйте желаемый процент. Как только целевые значения будут достигнуты, уменьшите скорость потока свежего газа до одного литра в минуту.
Герметичная камера может поддерживаться с такой скоростью потока газа до тех пор, как это необходимо для эксперимента. Курсы концентрации севофлюрана и изофлюрана в среде были схожи с течением времени. Сразу же после того, как была установлена необходимая концентрация галогенированного агента, концентрации возросли в течение первого часа.
Затем было достигнуто плато, которое сохранялось до тех пор, пока не было остановлено управление галогенированным агентом. После перерыва в работе администрации концентрация снизилась в течение одного часа. Здесь показаны фракции галогенного агента с течением времени в герметичной камере, измеренной газоаанализатором.
Эта процедура является относительно недорогим и очень легко принять, даже если исследователи никогда не манипулировали герметичной камере раньше. После этой процедуры, другие методы, такие как белок и РНК количественной оценки, иммунофторесценции, измерения проницаемости белка и свободного транспорта могут быть выполнены для того, чтобы ответить на вопросы о конкретных последствиях галогенных агентов во время эпителиальной травмы легких и его разрешения. После его развития, этот метод может проложить путь для исследований в области острого респираторного дистресс-синдрома для дальнейшего изучения механизма, участвующих в эпителиальной травмы легких во время ОРДС и для тестирования новых методов лечения.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен простой протокол для достижения точных концентраций севофлурана или изофлурана in vitro. Метод направлен на углубление понимания механизмов эпителиального повреждения легких и оценку новых методов терапии острого респираторного дистресс-синдрома.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Пульмонология
- Фармакология
Теоретические основы
- Острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) представляет собой критическое состояние, требующее разработки новых терапевтических подходов.
- Галогенированные агенты, такие как севофлуран и изофлуран, могут обладать потенциалом в лечении повреждений легких.
- Понимание механизмов повреждения легких необходимо для разработки эффективных методов лечения.
- Данное исследование посвящено методу контроля воздействия этих агентов в лабораторных условиях.
Цель исследования
- Разработать надежный протокол для изучения повреждения и восстановления легких.
- Протестировать галогенированные вспомогательные средства в качестве потенциальных методов терапии ОРДС.
- Углубить понимание механизмов эпителиального повреждения легких.
Используемые методы
- Создание герметичной камеры с использованием герметичного полипропиленового контейнера.
- Сверление отверстия для подачи газовой смеси и его герметизация силиконом.
- Методы культивирования клеток для воздействия на них галогенированных агентов.
- Достижение контролируемых концентраций севофлурана или изофлурана.
Основные результаты
- Метод позволяет точно контролировать концентрацию галогенированных агентов.
- Способствует изучению механизмов повреждения легких in vitro.
- Предоставляет платформу для тестирования новых методов терапии ОРДС.
- Демонстрирует простоту и эффективность данного протокола.
Выводы
- Разработанный протокол является ценным инструментом для исследования повреждений легких.
- Он открывает возможности для изучения новых терапевтических методов лечения ОРДС.
- Необходимы дальнейшие исследования для подтверждения полученных результатов и изучения возможностей их клинического применения.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный метод обеспечивает точный контроль концентрации галогенированных газов in vitro для изучения механизмов повреждения эпителия легких при ОРДС. Он представляет собой воспроизводимую платформу для оценки новых терапевтических средств, направленных на борьбу с повреждением и воспалением альвеол. Этот подход способствует валидации мишеней на ранних этапах и снижению механистических рисков при разработке лекарственных препаратов для лечения заболеваний легких.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, касающиеся роли галогенированных агентов в путях развития повреждения легких.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизированную систему функциональной валидации мишеней эпителиального ответа на воздействие анестетиков.
- Прогностическая ценность: повышает достоверность прогнозов за счет получения количественных данных о концентрации веществ в культуральной среде с временным разрешением.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга соединений с использованием контролируемого воздействия газа.
- Воспроизводимость: Обеспечение стабильных концентраций севофлурана и изофлурана в среде, что позволяет проводить надежную оценку соединений.
- Масштабируемость: Использование простой конструкции герметичной камеры, подходящей для многолуночных планшетов и повторных экспериментов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболевания: моделирует повреждение альвеолярного эпителия в физиологических условиях, соответствующих патофизиологии ОРДС.
- Трансляционная преемственность: связывает результаты исследований in vitro с доклинической валидацией путем определения порогов воздействия, связанных с биологическими эффектами.
- Оптимизация прогресса с учетом рисков: служит основой для принятия решений о продолжении или прекращении разработки путем установления зависимости между концентрацией и эффектом для скрининга безопасности и эффективности.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в континуум разработки лекарственных средств — от подтверждения взаимодействия с мишенью до оптимизации ведущих соединений, в частности, для препаратов для лечения заболеваний легких, воздействующих на воспалительные и повреждающие пути.
- Открывающая биология: Поддерживает проверку гипотез о роли галогенированных агентов как модуляторов механизмов повреждения и восстановления эпителия.
- Скрининг: Обеспечивает стандартизацию анализа за счет поддержания стабильных, измеряемых концентраций газа в жидкой фазе с течением времени.
- Аналитика: Позволяет получать количественные измерения зависимой переменной (например, концентрация в среде mg/L) с помощью газовой масс-спектрометрии для сравнения условий.
- Трансляционные исследования: Связывает динамику воздействия с биологическими результатами, обеспечивая преклиническую преемственность в соответствии с биомаркерами.
- Корпоративное повторное использование: Предлагает многократно используемую недорогую платформу для итерационного тестирования анестетиков или газообразных терапевтических средств в различных проектах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность в моделях повреждения легких за счет обеспечения контролируемых и воспроизводимых условий воздействия газа.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость благодаря конструкции герметичной камеры и мониторингу состава газа в режиме реального времени.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала, позволяя заблаговременно снизить риски при изучении галогенированных адъюнктов перед проведением дорогостоящих исследований in vivo.
- Влияние на портфель: Способствует приоритизации кандидатов в пульмонологические препараты с учетом рисков посредством четкого профилирования зависимости «доза-ответ» при воздействии.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами клеток на границе раздела фаз «воздух-жидкость» и системами подачи газа.
- Необходим доступ к контурам наркозных аппаратов, газоанализаторам и масс-спектрометрии для подтверждения концентрации веществ в среде.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов экспозиции, методов герметизации и контроля условий окружающей среды (37°C, 5% CO2).
- Необходимо учитывать особенности адаптации для различных типов клеток, форматов планшетов и галогенированных агентов, помимо севофлурана и изофлурана.
- Практические ограничения включают лимиты объема камеры и время уравновешивания (~1 hour) для достижения плато концентрации в среде.
