Использование оптическая когерентная томография и оптокинетический ответ как структурная и функциональная зрительная система отсчетов в мышей и крыс
10 января 2019 г.
Представлен подробный протокол для оценки структурных и визуального отсчетов на грызунах, оптическая когерентная томография и оптокинетический ответ. Результаты дают ценную информацию для офтальмологии, а также неврологических исследований.
Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы в области неврологии и офтальмологии, а также помочь оценить большое разнообразие ретинопатий и проявлений сетчатки в различных моделях грызунов. Основным преимуществом этих методов является то, что неинвазивные продольные исследования могут быть выполнены, уменьшая изменчивость и сокращая количество животных, необходимых для экспериментов. Эти методы позволяют количественно in vivo исследование структуры и функции, которые могут быть использованы для исследования патологических состояний, или для оценки потенциальной полезности новых терапевтических средств.
Однако, особенно применение технологии оптической скооренности томографии в моделях грызунов по-прежнему является сложной задачей, главным образом из-за небольшого размера глаз. Демонстрацией процедур будет Майкл Дитрих, аспирант нашей лаборатории. После анестезии грызунов, применить одну каплю фенилэфрин Tropicamide на каждом глазу для зрачка расширение.
Протрите любой избыток капли глаза мокрой через одну минуту. И смазать глаза метилцеллюлозы основе офтальмологического геля, чтобы избежать высыхания глаза и создания мутной роговицы. Затем используйте типсы, чтобы поместить пользовательские контактные линзы на глаз.
Нажмите кнопку «Пуск» в правом углу дисплея панели управления, чтобы начать режим приобретения. Далее, чтобы изображение левого глаза, положение держателя, чтобы убедиться, что левая лампочка глаза грызуна сталкивается с камерой. Установите уровень фильтра до R, и выберите BR и OCT для синих отражений fundus изображений и B-сканирования приобретения в программном обеспечении.
Затем установите расстояние фокусировки примерно до 38 диоптрий, используя ручку фокусировки на задней части камеры. И увеличьте масштаб сетчатки до тех пор, пока на экране не будет видно сканирование OCT. Затем, чтобы обеспечить путь пучка через середину зрачка, с ортогональным углом сетчатки во всех плоскостях, положение оптического диска в середине освещенного поля.
И отрегулируйте горизонтальную и вертикальную линию B-сканы до горизонтального уровня, вращая держатель. На экране программного обеспечения выберите режим сканирования громкости и установите его на 25 B-сканирований в режиме высокого разрешения при 50 автоматическом отслеживании в режиме реального времени. Центр середине сетки сканирования громкости на оптическом диске и начать приобретение, нажав на черную ручку чувствительности, а затем приобрести на панели управления.
После завершения приобретения установите уровень фильтра на A.Select Blue Autofluorescence на панели управления. И отрегулируйте яркость изображения с помощью ручки чувствительности. Нажмите ручку чувствительности, а затем приобрести для изображения флуоресцентных клеток или аутофторесцентных отложений.
Для анализа объема сканирования используйте автоматизированную сегментацию программного обеспечения устройства OCT, нажав правой кнопкой мыши на сканировании. И выберите сегментации, то все слои. Выполните ручную коррекцию слоев, дважды нажав на нужное сканирование.
Выберите профиль thickness. И нажмите на сегментации слоя редактирования. Выберите один слой за один раз.
И при необходимости исправить зеленую линию, перемещая красные точки, перетаскивая и опуская в правильное положение. Далее выберите карту thickness вкладки. Выберите сетку 1, 2, 3 миллиметра ETDRS.
Центр внутреннего круга на оптическом диске. Наконец, вычислите толщину слоев сетчатки из значений толщины, предоставляемых программным обеспечением для различных секторов сетчатки, представляющих интерес. Для расчета основных значений толщины от сканирования громкости используйте всю сетку ETDRS диаметром 1, 2, 3 миллиметра, которая охватывает угол около 25 градусов, за исключением внутреннего одного миллиметрового круга, который содержит оптический диск.
Начните с выбора платформы для измерения грызунов. Откройте окно Presettings, дважды нажав на программное обеспечение. Выберите Новую группу и выберите название группы, количество испытуемых, видов и штаммов.
Выберите переменный стимул, spatiotemporal частоты, контрастной чувствительности, скорости или ориентации в меню высадки и нажмите Создать новую группу. Сосредоточьтесь на платформе, манипулируя фокусным кольцом камеры в верхней части камеры. И откалибровать систему путем выравнивания красного круга вокруг черного круга на платформе.
Затем поместите грызуна на платформу и дайте ему адаптироваться к окружающей среде в течение примерно пяти минут. Затем начните измерение, выбрав левую стрелку для да или квадрата нет, если животное отслеживает или не отслеживает соответственно. Вручную выберите размер шага стимула, нажав на Стрелки вверх и вниз рядом с переменным стимулом.
Наконец, выберите вкладку Резюме и нажмите на таблицу файлов, экспорта или график для экспорта желаемого набора данных. Результаты показывают, что дегенерация внутренних слоев сетчатки уменьшается. И клинический балл EAE затухается во время курса EAE, когда вещество 1 вводилось.
Кроме того, OKR показывает улучшение остроты зрения животных, обработанных веществом 1 по сравнению с необработанными мышами MOG EAE, измеренными пространственным пороговым тестированием частоты в течение 120 дней. При выполнении измерений OCT важным шагом является ортогональная ориентация лазерного луча во всех плоскостях по отношению к сетчатке для обеспечения качества и воспроизводимости значений толщины. Для okR техники, различая отслеживания и нормальных поведенческих движений животного, требует некоторой подготовки следователя.
Важно быть ослепленным для экспериментальной группы. После этих исследований структурных и функциональных повреждений, происходящих в контексте экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, процедура также может быть полезна в других моделях, связанных с зрительной системой, в том числе, но не ограничиваясь моделями ретинопатии, или травмы зрительного нерва. Эти методы прокладывают путь для исследований in vivo в области неврологии и офтальмологии и легко передаются в клинические испытания.
Обзор
В данной статье представлен исчерпывающий протокол оценки структурных и визуальных показателей на моделях грызунов с использованием оптической когерентной томографии (OCT) и оптокинетического рефлекса (OKR). Эти неинвазивные методы позволяют получать данные, применимые как в офтальмологических, так и в неврологических исследованиях, что делает возможным проведение лонгитюдных исследований с меньшей вариабельностью и использованием меньшего количества животных.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Офтальмология
- Модели на грызунах
Обзор
- Исследование сосредоточено на оценке ретинопатий и проявлений поражений сетчатки у грызунов.
- В нем освещаются трудности, связанные с применением ОКТ из-за малого размера глаз грызунов.
- ОКТ и ОКР позволяют проводить количественное исследование структуры и функции сетчатки in vivo.
- Эти методы предоставляют ценные данные для оценки потенциальных терапевтических средств и понимания патологических состояний.
Цель исследования
- Разработать и продемонстрировать протокол использования ОКТ и ОКР в исследованиях на грызунах.
- Изучить структурные и функциональные повреждения в контексте экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ).
- Оценить эффективность новых терапевтических веществ на доклинических моделях.
Используемые методы
- Для обеспечения комфорта грызунов во время процедур ОКТ и ОКР была проведена анестезия.
- ОКТ-визуализация выполнялась с использованием специальной контактной линзы и определенных настроек программного обеспечения для сканирования с высоким разрешением.
- Платформа ОКР предполагала предъявление различных стимулов для оценки способности к визуальному отслеживанию.
- Ключевые этапы включали тщательную калибровку и процедуры сбора данных для обеспечения надежных результатов визуализации и отслеживания.
Основные результаты
- Результаты указали на снижение дегенерации внутренних слоев сетчатки у подвергнутых лечению грызунов.
- У леченых животных наблюдалась повышенная острота зрения по сравнению с контрольной группой, не получавшей лечения.
- Данные свидетельствуют о том, что эти методы позволяют надежно измерять изменения в сетчатке и зрительную функцию с течением времени.
Выводы
- Данное исследование демонстрирует жизнеспособность ОКТ и ОКР как мощных инструментов для исследований in vivo в области неврологии и офтальмологии.
- Полученные результаты позволяют проводить дальнейшее изучение патологии сетчатки и оценку новых терапевтических методов вмешательства.
- Представленные методологии могут внести значительный вклад в разработку протоколов клинических исследований и понимание нарушений зрительной системы.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Сочетание структурных и функциональных показателей зрительной системы позволяет проводить лонгитюдную количественную оценку целостности сетчатки и зрительной функции на моделях грызунов, что способствует механистическому снижению рисков в программах доклинических исследований в области неврологии и офтальмологии. Этот двухмодальный подход снижает экспериментальную вариабельность и количество используемых животных, обеспечивая при этом трансляционные конечные точки для оценки нейропротекторных или модифицирующих болезнь терапевтических средств. Данная методология повышает прогностическую достоверность валидации мишеней за счет корреляции структурных изменений сетчатки с функциональными результатами зрения в различных моделях заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественного определения толщины слоев сетчатки в качестве структурного биомаркера нейродегенерации или нейропротекции.
- Практическая ценность: обеспечивает воспроизводимые неинвазивные структурные показатели, которые поддерживают функциональную валидацию мишеней при модуляции зрительного пути.
- Прогностическая ценность: коррелирует структурные изменения сетчатки, полученные с помощью ОКТ, с остротой зрения, измеренной методом OKR, что повышает уверенность в воздействии на мишень и модуляции пути.
Скрининг и разработка методов анализа
- Готовность анализа: Установление стандартизированных процедур ОКТ и ОКР для количественной визуализации in vivo и поведенческого мониторинга, что обеспечивает надежный скрининг соединений.
- Воспроизводимость: Облегчение лонгитюдного отслеживания структуры и функции сетчатки, что снижает межиндивидуальную изменчивость между животными и повышает точность анализа.
- Масштабируемость: Поддержка адаптации для высокопроизводительного анализа за счет настраиваемых параметров стимулов и автоматизированной сегментации для получения согласованных данных во всех исследованиях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для заболевания: демонстрирует применимость в моделях аутоиммунного энцефаломиелита (EAE), связывая сохранение структуры сетчатки с функциональным улучшением зрения и ослаблением клинических симптомов.
- Трансляционная преемственность: обеспечивает переход от этапа открытия к доклинической валидации путем измерения как нейродегенерации сетчатки, так и восстановления зрительной функции в течение длительных периодов времени.
- Прогресс с учетом рисков: поддерживает принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), демонстрируя вызванное веществом снижение дегенерации внутреннего слоя сетчатки и улучшение порогов пространственных частот в течение 120 дней.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в общий цикл разработки лекарственных средств — от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинических испытаний эффективности, предоставляя структурные и функциональные конечные точки, которые позволяют оценить биологическую активность и терапевтический потенциал.
- Открывающая биология: Способствует проверке гипотез, обеспечивая количественное исследование структуры и функции сетчатки in vivo в моделях нейродегенерации и нейропротекции.
- Скрининг: Предоставляет готовые к анализу, воспроизводимые карты толщины структур и метрики функционального отслеживания для надежной оценки соединений в тестах зрительной системы.
- Аналитика: Формирует профили толщины отдельных слоев и пороги пространственной частоты, что позволяет проводить сравнение различных условий и анализ зависимости «доза-эффект».
- Трансляционные исследования: Связывает сохранение структуры сетчатки с восстановлением функциональной остроты зрения, поддерживая согласование биомаркеров и преклиническую преемственность в моделях неврологических заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую платформу для лонгитюдной оценки зрительной системы при различных нозологиях и терапевтических методах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность за счет снижения механистической неопределенности благодаря коррелированным структурным и функциональным показателям визуальной системы.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию и воспроизводимость с помощью калиброванных протоколов визуализации и процедур слепого поведенческого трекинга.
- Стратегическая ценность: оптимизирует процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), обеспечивая ранние транслируемые биомаркеры изменений функций сетчатки и зрения, что снижает биологические риски на поздних стадиях.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию кандидатов с учетом рисков, выбирая препараты, демонстрирующие как сохранение структуры сетчатки, так и улучшение зрительных функций в доклинических моделях.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с грызунами, подготовка офтальмологических образцов и навыки работы с системой ОКТ/ОКР для надежного сбора данных.
- Необходимы специализированные держатели, контактные линзы и откалиброванные системы визуализации, подходящие под размер глаза мелких грызунов и обеспечивающие соосность луча.
- Требуется стандартизация протоколов анестезии, расширения зрачка, увлажнения и визуализации между исследовательскими группами для обеспечения согласованности данных между центрами или исследованиями.
- Необходимо учитывать адаптацию параметров стимула (пространственно-временная частота, контрастность, скорость) в тестах ОКР для различных видов и линий животных.
- Существуют практические ограничения, такие как необходимость обучения исследователей для дифференциации истинного оптокинетического слежения от обычных поведенческих движений, а также обеспечение слепого метода при оценке результатов.
