Скрининг Хлопковых Генотипов для Сопротивления Нематод Рениформ

Здесь представлен протокол для быстрого неразрушающего скрининга хлопковых генотипов на рениформную устойчивость нематод. Протокол включает в себя визуальное изучение корней нематод-инфицированных саженцев хлопка для определения реакции инфекции. Вегетативная съемка с каждого растения затем распространяется для восстановления растений для производства семян.

Этот метод может помочь в развитии реиформных сортов хлопка, устойчивых к нематоду. Путем выявления устойчивых генотипов других видов хлопка и оценки популяций размножения. Основным преимуществом этого метода является то, что он обеспечивает простой и неразрушающий метод для реиформирования нематодного скрининга.

Начните с размещения шарик хлопка в нижней части одного четыре сантиметра диаметром, 21 центр высоты конической пластиковый горшок на семя. И заполнение горшков паровой пастеризованной почвенной смесью примерно на два сантиметра от верхней части горшка. Поместите пластиковую колу в каждый горшок, назойляя генотип, который будет посажен, и посадите одно семя соответствующего генотипа хлопка в каждый горшок.

Заполните каждый горшок с дополнительной почвой, чтобы покрыть семена и поместить горшки в камеру роста установлена постоянная температура 28 градусов по Цельсию с 16-часовой флуоресцентный и лампы накаливания фото период. Затем поместите излучатели воды в каждый горшок и использовать автоматическую систему полива поливать горшки два раза в день. Через семь дней после посадки, создать небольшую депрессию в почве рядом с каждым растением и добавить один миллилитр reniform нематод подвески в каждой депрессии.

После прививки, горшок воды необходимо тщательно контролировать, с тем чтобы предотвратить мытье нематод из корневой зоны. Через 28 дней после прививки, используйте ножницы, чтобы удалить большую часть полностью расширенных листьев из растений, прежде чем сжать каждый горшок и скольжения почвы в одну руку, чтобы удалить растения. Аккуратно агитировать корневую систему в водопроводной воде в 10-литровом контейнере, чтобы удалить почву из корней, а затем краткое полоскание в контейнере чистой водопроводной воды.

Используйте ножницы, чтобы удалить очищенную корневую систему с растения примерно на один сантиметр ниже линии почвы. Поместите корни в пластиковый 120 миллилитровый нестериленый одноразовый контейнер образца. Далее, полностью покрыть корневую систему примерно 30 миллилитров красного пищевого раствора окраски и поместить образец контейнера в микроволновую печь для нагрева окрашивания раствора, пока он не начинает кипеть.

Когда образец остынет до комнатной температуры, замените красный пищевой краситель раствором со 100 миллилитров водопроводной воды, чтобы удалить излишки пятна. Затем поместите крышку на контейнер образца и хранить образец на четыре градуса по Цельсию до анализа корневой инфекции. Чтобы восстановить растения для производства семян, поместите шарик хлопка в нижней части нового конического пластикового горшка и частично заполнить горшок с торфяным мхом заливки среды.

Поместите один корень системы собранных вегетативных стрелять в кастрюлю и твердо добавить горшок среды для заполнения горшок. Поместите новый помеченный пластиковый кол в каждый горшок, чтобы обозначить генотип хлопка и поместить поднос горшков в пластиковый контейнер с водой. Кратко поливать растения, чтобы смочить горшок среды и поместить горшки в камеру роста установлена постоянная температура 28 градусов по Цельсию и 16-часовой период фото.

Примерно через 30 дней, частично заполнить один шесть литров пластиковый горшок на растение с горшок среды. Перенесите каждое растение в шестилитровый горшок, твердо добавляя среду заливки в каждый горшок, как каждый рассада посажена. Затем поместите растения в стеклянный дом и добавить воду, чтобы смочить горшок среды.

Чтобы оценить корневую инфекцию R.reniformis, удалите образец корня из контейнера образца. Используйте стерео микроскоп, чтобы подсчитать количество женских нематод, прикрепленных к корневой системе под увеличением 20X. Успешная инфекция корневой системы нематод может зависеть от нескольких факторов, в том числе жизнеспособности нематод, используемых для прививки и сезонных изменений, так как нематоды менее активны в зимние месяцы.

Затем поместите корневую систему на бумажные полотенца в течение примерно 10 минут, чтобы удалить избыток влаги. Взвесить корневую систему, чтобы определить свежий вес корня. Вариации в росте корней являются общими между эксцисами.

Эти изменения, измеряемые свежим корневым весом, также могут наблюдаться между растениями одного и того же генотипа. Относительно меньше женщин reniform нематод способны создать место кормления для устойчивых генотип хлопка по сравнению с восприимчивым генотипом. Свежие данные о весе корней могут быть использованы для расчета количества женских нематод на грамм корневой ткани для каждого генотипа.

Количество женских нематод на грамм корня устойчивых генотипов, как правило, меньше 10, в то время как восприимчивые генотипы обычно имеют более 30 нематод на грамм корня. Здесь показан подмножество данных из сегрегации популяции F2, которая включала 300 растений. Эти диапазоны в вариациях для роста корней и нематод инфекции корневых систем обычно наблюдаются для нематод оценки, иллюстрирующие способность этой процедуры, которые будут использоваться для проверки большого количества растений в одном эксперименте, чтобы свести к минимуму это изменение, и облегчить точную оценку генетики резистентности.

После этой процедуры, генетика реиформной устойчивости нематод может быть определена для выявления маркеров ДНК, связанных с сопротивлением. Эти маркеры могут быть использованы для разведения с помощью маркеров и для передачи нематодной устойчивости к хлопку на суше. После его разработки, этот метод предоставил неразрушающий метод, позволяющий исследователям восстановить растения после нематод повторного скрининга, чтобы помочь в разведении устойчивых сортов хлопка.