Как определить долю флуоресцентных белков Photoactivated навалом и в живых клеток

Мы представляем здесь протокол, который включает в себя генетически соединенные спектрально различные фотоактивируемые и флуоресцентные белки. Эти внутренние правители позволяют количественно ПАФП фракции, которая фото активируется, чтобы быть флуоресцентным. До сих пор не было доступно никакого метода количественной оценки оптом в клетках жизни, сколько из PAFP выразил фото активируется для флуоресца. Представленная количественная оценка эффективности фотоактивации является примером для PA-GFP и PA Cherry в живых клетках, но она в принципе широко применима и может быть использована для любого фотоактивируемого флуоресцентного белка при любом экспериментальном состоянии. Всякий раз, когда работа с генетически закодированными флуоресцентными белками, абсолютное количество выраженных белков варьируется от клетки к клетке, и это неизвестно. Чтобы стандартизировать экспрессию между клетками, мы вводим внутренние линейки генетически соединенных спектрально различных флуоресцентных белков. Путем соедать генетическую информацию фотоактивируемого флуоресцентного протеина к spectrally отчетливым всегда на флуоресцентных правителях протеина внутренне созданы которые все еще будут выражены к неизвестному полному количеству но в сториченном известном относительном количестве одного к одному. Чтобы начать строительство плазмидов, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Кроме того, культура в стандартной клеточной линии в своей перспективе среды с использованием фенола красный бесплатная версия. Когда готовы начать эксперимент, урожай клеток с помощью трипсина без фенола красный, чтобы уменьшить фон флуоресценции. После сбора урожая заполните 2 мл пипетки с клеточной подвеской из культуры стеченных клеток, выращенных в колбе культуры Т 12,5 клеток. Добавьте по одной капле в каждую камеру восьми камерного стеклянного слайда. Инкубировать слайд в стандартных условиях культуры клеток в течение 24 часов. Далее трансфект клеток с использованием коммерческих реагентов в соответствии с протоколом дистрибьюторов. Transfect клетки с GFP Черри, PA-GFP Черри и GFPPA Черри химер. Затем верните клетки в инкубатор, чтобы обеспечить экспрессию белка, складывание и созревание. После в общей сложности 20 часов после трансфекции, перенести клетки на стадию конфокального флуоресцентного микроскопа, оснащенного увлажненной и нагретой экологической камерой, предварительно разогретой до 37