Фотообесцвечивание позволяет супер резолюции изображений FtsZ кольца в цианобактерии Prochlorococcus

Здесь мы описываем метод Фотообесцвечивание для снижения аутофлюоресценция цианобактерий. После Фотообесцвечивание стохастический оптических реконструкции микроскопии используется для получения изображений трехмерных суперразрешением цианобактерий кольца FtsZ.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы по локализации белка и динамике в фотосинтетических организмах. Объединив метод фотоблейинга с микроскопом супер-разрешения, мы можем обнаружить белковую динамику фотосинтетических организмов в замечательной детали. Этот метод не только дает представление о белковой динамике Прохлорококка.

Он также может быть применен ко многим другим организмам, содержащим радио-re-dop-sing и bacteriochlorophyll. Демонстрацией этой процедуры будет Янсин Лю, аспирант моей лаборатории. Для начала добавьте пять миллилитров морской воды на основе среды Pro99 в культурную колбу и прививайте ее одним миллилитром Prochlorococcus MED4.

Выращиваем прохлорококк при 23 градусах Цельсия при свете с интенсивностью 35 микромоленых фотонов на квадратный метр. Через пять дней соберите один миллилитр культуры в 1,5 миллилитровую трубку. Добавьте 100 микролитров свежеприготовленного формальдегида в трубку, чтобы исправить культуру.

Инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем, спина вниз образца на 13500 раз G в течение одной минуты. Удалите супернатант и повторно наполните клетки в 100 микролитров среды Pro99.

Храните образец при четырех градусах Цельсия в темноте до готовности к проведению иммуностимулятора. Во-первых, вихрь флакон из полистирола бисера. Используя 50% этанола, приготовьте разбавление от одного до 20 000 в качестве рабочей суспензии.

Включите плиту и установите температуру до 120 градусов по Цельсию. Затем поместите крышки на горячую тарелку. Загрузите 100 микролитров рабочей суспензии на каждую крышку и инкубировать крышки на плите в течение 10 минут.

Затем осторожно перенесите крышки в чашки Петри бисером для хранения при комнатной температуре. Когда готовы покрыть крышки, получить один, убедившись, что это бисером вверх. Добавьте 100 микролитров по 1 миллиграмму на миллилитр раствора поли-L-лизина в центр крышки и дайте ему сидеть при комнатной температуре в течение 30 минут.

После этого используйте пипетку, чтобы тщательно аспирировать любой непривязанный поли-L-лизин и перенести его в 1,5 миллилитровую трубку. Храните этот поли-L-лизин при четырех градусах цельсия для более длительного использования. Промыть крышку 10 миллилитров ультра фильтрованной воды в 60-миллиметровой чашке Петри, а затем кратко высушить его бумажным полотенцем.

Перенесите крышку с покрытием на новую чашку Петри с Parafilm внизу, которая будет использоваться в качестве окрашивания. Загрузите 100 микролитров фиксированного образца на крышку и дайте ему сидеть в течение 30 минут, чтобы позволить вложение ячейки. Затем используйте бумажное полотенце, чтобы поглотить оставшийся раствор, а затем передать крышку в колодец в 12-хорошо пластины для мытья.

Добавьте один миллилитр буфера PBS к хорошо для мытья крышки. Затем удалите PBS и добавить один миллилитр свежего PBS для мытья крышки во второй раз. Используйте пипетки, чтобы удалить PBS и заменить его на один миллилитр свежеприготовленного буфера протеабилизации.

Инкубировать мытье посуды при 37 градусах по Цельсию в течение 20 минут. Затем удалите буфер пермеабилизации. Начните процесс стирки, добавив один миллилитр свежего буфера PBS.

Поместите мытье посуды на шейкер, чтобы аккуратно агитировать блюдо в течение пяти минут. После этого удалите PBS и повторите процесс стирки три раза. Перенесите промытую крышку на окрашивание блюда.

Добавьте 50 микролитров блокирующего буфера в верхней части крышки. Поместите все окрашивание блюдо на лед, а затем переместить его под ксенон источник света для фотоотливания, по крайней мере 60 минут. После фотоблейинга и блокировки используйте край бумажного полотенца для удаления блокирующего буфера.

Во-первых, разбавить один микролитер анти-Fts' антитела в 99 микролитров блокирующего буфера. Поместите 50 микролитров разбавленного первичного антитела на крышку и инкубировать его при комнатной температуре в течение 30 минут. Перенесите крышку в колодец стиральной тарелки.

Для начала стирки добавьте один миллилитр PBS. Затем перенесите мытье посуды в шейкер и аккуратно встряхните его в течение пяти минут. Удалите PBS и повторите весь процесс стирки три раза.

Затем перенесите крышку на окрашивание блюда. Поместите 50 микролитров разбавленного вторичного антитела на крышку и инкубировать его в темноте и при комнатной температуре в течение 30 минут. Перенесите крышку обратно в стиральную тарелку.

Для начала стирки добавьте один миллилитр PBS. Оберните стиральную тарелку в алюминиевую фольгу, чтобы защитить ее от света. Перенесите тарелку в шейкер и аккуратно встряхните ее в течение пяти минут.

Удалите PBS и повторите весь процесс стирки три раза. Непосредственно перед изображением STORM подготовьтесь к одному миллилитру буфера изображений, как указано в текстовом протоколе. Загрузите крышку в погрузочную камеру.

Добавьте свежеприготовленный буфер изображения, будучи нежным, чтобы избежать смывания цианобактериальных клеток. После этого поместите прямоугольный крышку поверх буфера изображения, чтобы предотвратить его реакцию с кислородом в воздухе. Включите камеру, светодиодный свет и лазер и откройте программное обеспечение STORM.

Добавить пол капли масла погружения на верхней части объектива. Загрузите камеру, убедившись, что объектив цели соего контакта с крышкой. И изучите сигнал с помощью 750-нанометрового лазера.

Определите область выборки, которая содержит как клетки, так и фидуциальные маркеры. Затем запустите программное обеспечение для коррекции проб дрейфа. Приобрети одно широкое изображение в качестве эталона, с увеличением умножения электронов камеры на 300 и временем экспозиции 30 миллисекунд.

Увеличьте интенсивность лазера возбудивания 750 нанометров примерно до 4,5 киловатт на квадратный сантиметр. После того, как флюорофоры перешли в разреженный мигающий узор, приобрети одно изображение супер-разрешения, собрав 10 000 кадров на 33 герц. Затем реконструируют изображения супер-разрешения из необработанных данных, изложенных в текстовом протоколе.

В этом исследовании, STORM используется для достижения супер-разрешение изображения путем активации отдельных фото-переключаемых фторфоров стохастично. Расположение каждого фторфора записывается, и изображение с супер-разрешением затем строится на основе этих мест. В то время как спектры поглощения Prochlorococcus достигает 447 и 680 нанометров и имеет минимальное поглощение выше 700 нанометров, клетки Prochlorococcus MED4 по-прежнему излучают высокую аутофторесценцию при воздействии чрезвычайно высокой интенсивности 750-нанометрового лазера, который необходим для визуализации STORM.

После использования метода фотоотливания, описанного здесь в течение 30 минут, наблюдается снижение аутофторесценции клеток, хотя несколько клеток с аутофторесценцией все еще обнаружены. Удлинение фотооттеки до 60 минут приводит к потере большинством клеток аутофторесценции. Эти результаты свидетельствуют о том, что разработанный метод фотоблейинга способен значительно снизить аутофторесценцию фотосинтетических организмов.

После фотоблейинга, STORM используется для визуализации белка деления клеток, Fts, в клетках. С помощью STORM раскрывается подробная морфология кольца Фтса. Путем вращать изображения 3D STORM, 4 по-разному типа морфологий были определены, кластеры, неполное кольцо, вполне кольцо, и двойные кольца.

Важно помнить, что интенсивность света и продолжительность фотоблейча могут отличаться для разных организмов. После своего развития, этот метод прокладывает путь для исследователей, которые хотят изучить организацию белка и потенциальную функцию в фотосинтетических клетках в деталях.