Крупномасштабные протеомики сверху вниз с использованием зоне капиллярного электрофореза тандем масс-спектрометрия

Этот метод может помочь улучшить крупномасштабную и высокое разрешение характеристики белковых изоформов и белковых пост-трансляционных модификаций в клетках. Основным преимуществом этой техники является то, что электрофореза капиллярной зоны масс-спектрометрия предлагает высокоэффективное разделение и высокочувствительный обнаружение нетронутых белков. Для предварительной лечения капилляров, высушите его азотным газом при 10 пси, по крайней мере 12 часов.

Затем заполните капилляр с 50% объем за объемом 3-пропил метакрилат в метаноле с помощью шприц насоса. Печать обоих концах капилляров с кремнезема резины. После инкубации при комнатной температуре в течение по крайней мере 24 часов, продолжайте с линейным полиакриламинидным покрытием на внутренней стене капилляра разделения, как описано в текстовом протоколе.

Сожгите часть капилляра, используя нежное пламя, чтобы удалить полиамидное внешнее покрытие примерно в четырех сантиметрах от одного конца капилляра. Аккуратно очистите обожженную часть капилляра, вытирая, чтобы удалить полиамидное покрытие полностью. Просверлите небольшое отверстие в конце 200 микролитровой трубки примерно такого же размера, как капиллярный внешний диаметр, чтобы достаточно держать капилляр на месте, как только он резьбой через это отверстие.

Нить конца капилляра, который находится близко к сгоревшей части через отверстие, пока сожгли часть находится в трубке. Затем добавьте приблизительно 150 микролитров HF в 200 микролитровую трубку, чтобы раствор HF был примерно на полпути вверх по сгоревшей части капилляра. Инкубировать капилляр в растворе HF при комнатной температуре от 90 до 100 минут.

Подготовь стандартную белковую смесь и образец E.coli, как описано в текстовом протоколе. Для настройки электрофорезной капиллярной зоны, или системы СЗЕ, загрузите образец, фоновый электролит и капилляр разделения на автосборщик СЗЕ. Выберите выборку нагрузки на странице ручного управления автоотборчиком СЗЕ.

Загрузите фоновый электролитный флакон в буферный лоток автосборщика, упомятв его положение в буферной подносе. Затем загрузите пробный флакон в образец лотка автоотборщика, упомятв его положение в пробе лотка. Поместите авто-образец в положение выравнивания с помощью ручного управления.

Теперь загрузите капилляр разделения в авто-сэмплер СЗЕ, используя неизупленный конец капилляра. Отрегулируйте высоту конца инъекций капилляра, если объем выборки ниже 50 микролитров. Переключите авто-образец в режим ожидания с помощью ручного управления.

Ввести положение образца в системе и перемести капилляр в образец. Нажмите конец инъекции капилляров дальше вниз, чтобы достичь нижней части пробного флакона. Продолжая использовать ручное управление, промыть капилляр с фоновым электролитом в течение 20 минут, используя давление 20 пси.

Теперь смонтировать коммерческий электрокинетически накачанный интерфейс потока оболочки к передней части масс-спектрометра. Заполните буферный резервуар оболочки буфером, содержащим метанол объемом 10% объема и 0,2% объемной мимической кислоты в воде класса LCMS. Промыть T в интерфейсе с оболочкой буфера путем применения давления вручную со шприцем.

Нить один миллиметр внешнего диаметра конца излучатель электроспрей через рукав трубки и подключить излучатель с одним портом T через установку. Просто промойте T вручную снова со шприцем, чтобы заполнить излучатель с оболочкой буфера. Отрегулируйте расстояние между отверстием излучателем и входом в масс-спектрометр примерно до двух миллиметров с помощью камеры, которая пришла с интерфейсом.

Нанесите напряжение от 2 до 2,2 киловольта на буферный флакон оболочки для электроспрей. Затем отрегулируйте напряжение брызг, чтобы достичь стабильного электроспрей. Применить низкое давление в конце инъекции капилляров во время этого процесса, чтобы убедиться, что Есть нет пузырьков в капилляре.

Выключите напряжение брызг и аккуратно нить травления конце разделения капилляров через T в излучатель, пока он не может быть толкнул дальше. После остановки низкого давления в конце инъекции капилляра, промыть излучатель немного с оболочкой буфера. Опять же, применить от двух до 2,2 киловольт распыления напряжения для проверки спрей.

Выберите новый метод под меню высадки файлов на главном экране инструмента. Там, выберите вход в качестве стартового образца флакона, окончание образца флакона, лоток в качестве образца, давление, как пять пси, киловолты, как ноль, и продолжительность, как 95 секунд для инъекции образца. Затем установите вход в качестве флакона, лоток в качестве буфера, давление, как нулевой пси, киловолты, как 30, и продолжительность, как 4200 секунд для разделения стандартного образца смеси белка.

Для разделения образца протеома E.coli, установить вход в качестве вайла, лоток в качестве буфера, давление, как нулевой пси, киловолты, как 20, и продолжительность, как 6600 секунд. Наконец, выберите вход в качестве флакона, лоток в качестве буфера, давление как 10 пси, киловольты, как 30, и продолжительность, как 600 секунд для капиллярного промывки. Теперь, установка MS и MS / MS параметров для нетронутого анализа белка с помощью четырехкратной ионные ловушки маска спектрометра.

Чтобы настроить настройки файла настройки, включите режим нетронутого белка и используйте давление захвата 0,2. Установите температуру капиллярного переноса иона до 320 градусов по Цельсию, а уровень S-lens RF до 55. Для выполнения эксперимента по СЗЕ МС/МС запустите метод сбора данных на компьютере масс-спектрометра, сначала выбрав последовательность запуска.

Затем запустите капиллярную последовательность электрофореза на капиллярной электрофорезной автоматической пробоотборной компьютере. Выполните поиск по базе данных с помощью TopPIC в наборе TopPIC и в графическом пользовательском интерфейсе TopPIC. Нажмите на файл базы данных и выберите соответствующую базу данных для поиска.

Нажмите на файл спектра и выберите генерируемый ms2. msalign файл, генерируемый в качестве ввода. Выберите файл функции MS1 и выберите файл сгенерированных функций.

Установите карбамид цистеин C57 в качестве фиксированной модификации из-за лечения иодоацетамида. Выберите функцию базы данных приманки и в настройках отсечения выберите ложную скорость обнаружения в меню высадки рядом с уровнем спектра. Установите скорость ложного обнаружения до 0,01 на уровне спектра.

Оставьте функцию генерации невыбранной и установите допуск к ошибкам до 15 частей на миллион. Установите скорость ложного обнаружения до 0,05 на уровне протеоформа. По продвинутым параметрам выберите два для максимального количества массовых смен в меню высадки.

Установите максимальную массовую смену неизвестных модификаций до 500 дальтов. Оставьте все остальные параметры на значениях по умолчанию и нажмите кнопку "Пуск" в правом нижнем углу графического пользовательского интерфейса. Показана репрезентативная электроферограмма стандартной белковой смеси.

Стандартная белковая смесь обычно работает по крайней мере в дубликате для оценки эффективности разделения и воспроизводимости системы. Эффективность разделения можно оценить с числом теоретических плит некоторых протеинов. Воспроизводимость может быть оценена по относительным стандартным отклонениям интенсивности белка и времени миграции.

Платформа СЗЕ MS/MS может быть использована для крупномасштабной характеристики протеоформ в различных сложных протеомах, выявляя более 500 протеоформ и 190 белков из протеома E.coli в одном запуске с высокой уверенностью. Здесь для оценки окна разделения системы можно использовать увеличенное изображение электроферограммы. Очень низкая E-значение и спектральные FDR свидетельствует о высокой уверенности proteoform ID.The большое количество соответствует фрагмент ионов дополнительно указывает на высокую достоверность ID.While попытка этой процедуры, важно помнить, чтобы нить травления разделения капилляров в излучатель электроспрей медленно и мягко.

Стабильная маркировка изотопов или методы без меток могут быть включены в процедуру СЗЕ MS, чтобы определить, как протеоформное изобилие изменяется в клетках в различных условиях. После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области сверху вниз протеомика для изучения роли протеоформ в регулировании различных биологических процессов в клетках. Не забывайте, что работа с гидрофторной кислотой может быть чрезвычайно опасной и такие меры предосторожности, как надлежащее личное защитное оборудование и наличие чрезвычайных процедур на месте всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.