Воспроизводимость dsRNA микроинъекции и откладки яиц биопроб в комаров и мух в дом

Этот протокол описывает микроинъекции методологии, которая у нас есть стандартизированы и используются на протяжении нескольких лет для доставки определенного количества нуклеиновые кислоты непосредственно гемолимфа комаров и мух в дом. Этот протокол приводит к минимальным инъекции смертности и позволяет дозы коррелированных измерений плодовитость.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биопестицидов, такие как, как двойной нити РНК влияние экспрессии генов, и плодовитость у взрослых диптеранов. Основным преимуществом этого метода является то, что поддающиеся количественной оценке дозы двойной нити РНК доставляются комару или мухе, и в результате этого можно оценить летальность нескольких поколений. Хотя этот метод представлен для комаров, aedes aegypti, и дом летать, musca domestica, он также может быть применен к другим видам комаров и мух.

Как правило, лица, новые для этого метода будет бороться, потому что освоение процедуры инъекций само по себе является инвестицией во времени. Инъекция каждого насекомого с оптимальным размером кончика иглы имеет решающее значение для обеспечения доставки при минимизации травм и смертности. Для начала используйте типсы для тщательной стадии комаров, чтобы они в конечном итоге подвергаются на слайде микроскопа примерно на пол сантиметра друг от друга.

Чтобы помочь обработке слайдов, оставьте пространство от одного до полутора сантиметров в левом или правом конце слайда. Затем поместите слайд постановочных насекомых при четырех градусах по Цельсию в большую чашку Петри. Наведините рассеченный микроскоп и микроинъектор над холодиленным столом.

После вытягивать стеклянные капилляры к точной подсказке, поместите капиллярную иглу в микроинъектор и сломайте кончик иглы типсами. Затем промыть иглу, рисуя и изгонять нуклеазы свободной воды три раза. Обратите внимание, что размеры стеклянных игл различаются между комарами и домашними мухами.

Далее приготовьте инъекционный раствор с соответствующей концентрацией для комаров. Добавьте три микрограмма на миллилитр родамина B в раствор, чтобы помочь в визуализации. Используйте пипетки, чтобы перенести три-четыре микролитров раствора на чистую поверхность, и втянуть его в стеклянную иглу, не принимая в любом воздухе.

Навямите кнопку впрыска повторно до тех пор пока жидкость не начнет dispense от иглы. Используйте ультра тонкий маркер точки, чтобы нарисовать хэш-метки примерно на один миллиметр друг от друга, начиная от жидкого мениска до голени иглы. Установите слайд комаров под иглу и убедитесь, что поле зрения достаточно широк, чтобы увидеть раствор мениска в игле.

Выровнять иглу со средней одной трети месокарапе грудины. Приготовьте комара к игле с помощью типсов, размещенных на противоположной стороне комара, и аккуратно проколите кутикулу кончиком иглы. Аккуратно сдвиньте иглу в комара, пока кончик не прошел через середину.

Угнетать кнопку впрыска до тех пор, пока не будет введено нужное количество жидкости. Если мениска не двигается, медленно сдвиньте комара или улетите с иглы, наблюдая за движением мениска. Если часть инъекционного раствора бисера из кутикулы при удалении иглы, или если мениск не может двигаться, отбросить насекомое, как инъекция не увенчалась успехом.

На дом летать, выровнять иглу с мезоплеуроном. Приготовьте муху к игле с помощью типсов, размещенных на противоположной стороне мухи, и аккуратно проколите кутикулу кончиком иглы. Передача инъекционных насекомых, чтобы очистить 3,5 унции проведения чашки в группах от 10 до 15.

Затем накройте чашку сеткой и дайте им восстановиться при комнатной температуре. После того, как насекомые выздоровели, инвертировать проведение чашку над ватным тампоном пропитанной 10% раствор сахарозы. Во-первых, заполнить 12-дюймовую искусственную мембрану свежей кровью, и нагреть его до 60 градусов по Цельсию в горячей водяной бане.

Высушите мембрану бумажным полотенцем и положите ее через крышку сетки удерживаемой чашки. После того, как комары питаются, замените ватный шарик и дайте комарам отдохнуть в течение 24 часов. Далее, построить oviposition чашки, заполнив ясно 3,5 унции био ацетат чашки с примерно 30 миллиметров деионизированной воды.

Затем поместите кусок бумаги прорастания семян в нижней части чашки. Обложка чашку с сеткой, и вырезать небольшую щель в сетке крышкой. Через 24 часа после кормления, вырезать небольшую щель в крышке удерживаемой чашки и передачи женщин, которые успешно кормили oviposition чашки.

Затем запечатать небольшую щель в крышке oviposition с 10% сахарозы насыщенный ватный шарик. Мониторинг комаров и отслеживание ежедневной смертности. После разрешения комаровoviposit в течение пяти-семи дней, подсчитайте яйца под рассечением микроскопа.

Демонстрация процедуры будет д-р Кристофер Геден, USDA ARS исследований энтомолог. Через три дня после инъекции, анестезировать мух с углекислым газом. Затем перенесите мух в чистую клетку с водой и подготовив диету мухи.

Запись данных о смертности, и удалить мертвых мух ежедневно. Далее, смешать 75%пшеничных отрубей с 25%pelleted живой корм по весу, чтобы подготовить личинки воспитания среды. Добавьте воду в смесь до достижения 62%влаги.

Добавить увлажневшиеся пшеничные отруби живой корм смеси на площади черной ткани, и свернуть его в шар. Используйте резинку, чтобы держать ткань на месте, и сжать осторожно, пока жидкая среда просачивается до конца. Поместите шарик в 60 миллилитровую чашку и поместите его в клетку для мух в течение пяти часов.

После этого смойте яйца с шарика, гарантируя, что яйца удаляются из-под складок ткани. Встряхните яйца, чтобы нарушить любые кластеры, и передать их окончил 20 миллилитров центрифуги трубки. Разрешить яйца оседают, и обратите внимание на объем поселились яйца в трубке.

Затем добавьте достаточно воды, чтобы довести объем до 20 раз объем оседлых яиц. Далее используйте магнитный бар перемешать, чтобы смешать воду и яйцо подвески. Наконец, используйте модифицированный наконечник пипетки, чтобы распределить 0,5 миллилитров подвески на кусок предварительно увлажненной черной ткани в серии линий.

В этом протоколе самки комаров вводились микро-инъекции для оценки экспрессии генов. Инъекционные самки с двойной рнк нити показали значительное снижение относительного выражения через несколько циклов овипозиции. Средние размеры сцепления у комаров в первом гонотрофном цикле были значительно уменьшены как для dsRPS6, так и для обработанных групп dsRPL26.

Очевидный эффект дозы наблюдался в размерах сцепления при введении dsRPS6 от одного микрограмма до 50 нанограмм у самок комаров. Дом мух были также введены с пятью микрограммами двойной нити РНК конструкций. Как и в случае наблюдений за комарами, было отмечено значительное сокращение как конкретного выражения стенограммы, так и размера сцепления.

При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы отказаться от насекомых, которые не были успешно введены. Используя эту процедуру, любая двойная конструкция РНК нити или другие биоратальные могут быть доставлены комаров или мух. Не забывайте, что работа со стеклянными иглами может быть опасной, и их всегда следует утилизировать в соответствующих контейнерах для отходов.