Репортер BW системы для изучения взаимодействия рецептор лиганд
7 января 2019 г.
Этот протокол описывает, как создать систему репортер, который может использоваться для идентификации и количественной оценки взаимодействия рецептор лиганд.
Shalom.The BW Репортер система позволяет изучать рецептор-лиганд взаимодействий. Это чрезвычайно полезно в тех случаях, когда лиганд конкретного рецептора неизвестен или в тех случаях, когда эксперименты с эндогенным лигандом технически сложны. Этот метод чувствителен и специфичен для индивидуального рецептора, прост в эксплуатации и воспроизводится.
Демонстрацией процедуры будет Шира Кахлон, постдок для моей лаборатории. За день до трансфекции, пластины 10 пластин с 10 миллилитров 100000 BW5147 клеток, и дополнить RPMI. Затем поместите 100 микрограммов плазмиды PCDNA3 в трубку.
Добавьте ацетат натрия при рН 5,3 в трубку. После этого добавьте 2,5 тома 100%этанола в плазмидную смесь. Затем инкубировать плазмидную смесь на ночь при температуре минус 20 градусов по Цельсию.
Через 24 часа после покрытия клеток BW, собирать клетки в двух 50 миллилитров труб. Затем центрифуга клетки на 515 г в течение пяти минут, и отказаться от супернатанта. Resuspend пелотон RPMI без дополнений и повторить центрифугации.
Resuspend в результате гранулы в 1 миллилитр RPMI без дополнений. Перенесите перерасходную гранулу на 4-сантиметровый кювет на льду. Центрифуга плазмида, которая прошла этанол осадков.
Затем промойте плазмид одним миллилитром 70%этанола. И повторите центрифугу еще на 20 минут. Удалите весь этанол и дайте грануле частично высохнуть.
Затем повторно посовещенные гранулы в 100 микролитров разогретой RPMI, без дополнений. После этого добавьте хлюпенированную плазмиду в клетки в кювете. Инкубировать клетки на льду в течение пяти минут.
Далее, электропорат клеток. Затем перенесите электропомерные клетки в 50-миллилитровую трубку. Добавить 50 миллилитров полной среды в трубку и центрифугу в течение пяти минут, при 515 г.
Отбросьте супернатант и повторно посовелите клетки в 50 миллилитров полной среды. Затем пластины клеток в 24-хорошо культуры блюда, и инкубировать клетки в течение 48 часов. После этого добавьте один миллилитр полной среды, дополненный 10 миллиграммами на миллилитр G418 к каждому хорошо.
48 часов спустя, отбросить один миллилитр верхнего объема каждой хорошо. Затем добавьте один миллилитр полной среды, дополненный пятью миллиграммами на миллилитр G418 к каждому хорошо. Используйте 50 000 трансфицированных клеток BW с желаемыми целями в одном колодец из пластины из 96 колодец.
Инкубировать тарелку в течение 48 часов. Затем заморозить пластину при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Пальто пластины ELISA с анти-мышь IL-2 антитела.
Поместите 05 микрограммов антимышки Ил-2 в объеме 50 микролитров PBS в каждую колодец. Инкубировать покрытием пластины на ночь при четырех градусах по Цельсию. Используйте короткий инкубационный период при 37 градусах по Цельсию, чтобы разморозить замороженные клетки BW, которые ранее были инкубированы своими целями.
Затем центрифуга пластины, и передать 100 микролитров supernatant от каждого хорошо предварительно покрытием пластины ELISA. И инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение двух часов. После этого добавьте биотин против мыши Ил-2 в пластину ELISA.
Затем после инкубации и стирки добавьте к пластине спряженный стрептавидин HRP. После инкубации и мытья добавьте 100 микролитров субстратного раствора TMB к каждой пластине ELISA. Наконец прочитайте пластину ELISA на 650 нанометров.
В этом примере клетки CLL были предварительно инкубированы различными антителами против CD20. А затем совместно инкубируется с трансфицированными клетками BW, которые выражают рецепторы Fc CD16, прежде чем анализировать с ELISA. После анализа с ELISA результаты были количественно.
Уровни оптической плотности, были преобразованы в концентрации мыши IL-2, на основе стандартной кривой. В дополнительном эксперименте различные дозы антител против CD20 были предварительно инкубированы клетками ХЛЛ. А затем инкубируется с трансфицированными клетками BW.
Частица содержит четыре основные части. Клонирование, трансфекция клеток BW, активация и ELISA. Каждая из частей должна быть проверена независимо.
После этой процедуры, дополнительные эксперименты могут быть выполнены с клетками, которые выражают эндогенные рецепторы, такие как убийство кислот с нк-клеток для изучения взаимодействия с рецепторами НК-клеток. Мы использовали эту систему, чтобы обнаружить новые лиганды рецепторов НК-клеток. Например, гемагглютинин является лигандом NKp46, а PVL является лигандом TG.
Обзор
В данной статье описывается система BW репортера — чувствительный и специфичный метод изучения взаимодействий рецептора и лиганда, особенно в тех случаях, когда лиганд неизвестен или с ним трудно работать. В системе используются клетки мыши BW5147, трансфицированные конструкцией химерного рецептора, что позволяет количественно определить активацию рецептора по секреции интерлейкина-2 (IL-2), определяемой с помощью ELISA. Этот подход облегчает анализ активации рецепторов различными лигандами, включая антитела и молекулы клеточной поверхности.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Клеточная биология
- Молекулярная биология
Теоретические сведения
- Взаимодействия рецептора и лиганда лежат в основе многих биологических процессов.
- Прямые эксперименты с нативными рецепторами и лигандами могут быть затруднительны из-за неизвестности лигандов или технических сложностей.
- Репортерные системы позволяют осуществлять чувствительную и специфичную детекцию активации рецепторов.
- Для измерения уровней активации рецепторов необходимы количественные анализы.
Цель исследования
- Разработать и продемонстрировать репортерную систему для детектирования взаимодействий рецептор-лиганд.
- Обеспечить возможность количественной оценки активации рецептора даже в случаях, когда лиганд неизвестен.
- Предложить воспроизводимый и простой в использовании метод исследования рецепторов.
Используемые методы
- Клонирование внеклеточного домена специфического рецептора, слитого с CD3ζ мыши.
- Трансфекция клеток BW5147 мыши конструктом химерного рецептора методом электропорации.
- Селекция трансфецированных клеток с помощью антибиотика G418.
- Инкубация трансфецированных клеток BW с клетками-мишенями или антителами.
- Измерение секретируемого IL-2 мыши методом ELISA в качестве показателя активации рецептора.
Основные результаты
- Репортерная система успешно регистрирует активацию специфических рецепторов различными лигандами.
- Количественное измерение секреции IL-2 коррелирует с уровнями активации рецепторов.
- Система была использована для изучения активации человеческих Fcγ-рецепторов антителами к CD20 на клетках ХЛЛ.
- Результаты могут быть стандартизированы путем пересчета оптической плотности в концентрацию IL-2 с использованием стандартных кривых.
Выводы
- Система BW-репортер представляет собой надежный инструмент для анализа взаимодействий рецептор-лиганд.
- Она применима даже в тех случаях, когда лиганд неизвестен или его трудно использовать в эксперименте.
- Данный метод является чувствительным, специфичным и позволяет проводить количественный анализ активации рецепторов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Система репортера BW позволяет проводить чувствительный количественный анализ взаимодействий рецептора и лиганда, даже если лиганд неизвестен или его использование затруднено технически. Эта возможность устраняет критический барьер на этапах раннего поиска и валидации мишеней, предоставляя воспроизводимую и масштабируемую платформу для исследований функциональной активации рецепторов. Система способствует снижению рисков для всего портфеля разработок и ускоряет подтверждение механизмов действия в ключевых точках разработки биопрепаратов и антител.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Обеспечивает функциональную валидацию активации рецепторов различными лигандами, включая неизвестные.
- Поддерживает снижение механистических рисков за счет изоляции специфических событий активации рецепторов.
- Способствует быстрому отбору потенциальных мишеней на основе количественных профилей активации.
- Предоставляет стандартизированный метод считывания данных для исследования сигнальных путей на основе выдвинутых гипотез.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает воспроизводимый количественный результат на основе метода ELISA для последующих этапов скрининга.
- Поддерживает стандартизацию анализа и воспроизводимость результатов в разных лабораториях при изучении рецептор-лигандных взаимодействий.
- Позволяет проводить масштабируемую оценку кандидатов из антител или клеточных лигандов.
- Подготавливает валидированные биологические системы для высокоточного анализа соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет данные об активации рецепторов с антителами или клеточной терапией, имеющими отношение к заболеванию.
- Обеспечивает преемственность процесса от этапа открытия до доклинической валидации функционального взаимодействия с рецептором.
- Поддерживает продвижение кандидатов в биологические препараты с учетом рисков на основе количественных порогов активации.
- Обеспечивает разработку трансляционных биомаркеров, когда активация рецептора является ключевой конечной точкой.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данная репортерная система применима на всех этапах: от начального поиска до идентификации ведущих соединений и доклинической валидации, предоставляя многократно используемую платформу для функционального анализа взаимодействия рецептора и лиганда.
- Биология открытий: Помогает в проверке гипотез и снижении рисков при изучении механизмов путем количественного определения активации рецепторов в ответ на воздействие потенциальных лигандов.
- Скрининг: Обеспечивает стандартизированные количественные результаты ИФА для сравнения эффективности и специфичности лигандов.
- Аналитика: Позволяет переводить значения оптической плотности в концентрацию IL-2 для проведения надежного статистического анализа в различных условиях.
- Трансляционные исследования: Связывает этап открытий с доклиническими исследованиями посредством подтверждения функционального взаимодействия с терапевтическими мишенями.
- Корпоративное повторное использование: Представляет собой модульную, адаптируемую систему для различных исследований рецепторно-лигандных взаимодействий в рамках разных программ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизированные, воспроизводимые и масштабируемые анализы активации рецепторов.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») и эффективность использования капитала за счет обеспечения раннего функционального скрининга.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение кандидатов из числа биологических препаратов и антител.
Особенности реализации
- Для создания химерных рецепторов требуются навыки молекулярного клонирования и трансфекции клеток.
- Необходим доступ к оборудованию для ИФА и аналитической инфраструктуре для получения количественных данных.
- Требуется межгрупповая стандартизация условий анализа и конвейеров обработки данных.
- Метод адаптируем к различным типам рецепторов и источникам лигандов, включая антитела и молекулы клеточной поверхности.
- Для получения надежных результатов необходима независимая верификация каждого этапа рабочего процесса.
