Оценка взаимодействия между дополнением белка C1q и гиалуроновой кислоты в содействии клеточной адгезии
15 июня 2019 г.
Дополнительным компонентом C1q является провоспалительная молекула, высоко выраженная в микроокружении тканей, которая может взаимодействовать с внеклеточной матрицей. Здесь мы описываем метод, чтобы проверить, как C1q связаны с гиалуроновой кислотой влияет на сливки клеток.
Комплексная процедура оценки взаимодействия между дополнением белка C1q и гиалуроновой кислоты в содействии клеточной адгезии. Недавно мы определили, что комплементный компонент C1q молекула врожденной иммунной системы высоко выражена в микроокурении опухоли и плаценты и способна взаимодействовать с компонентом внеклеточной матрицы. В этом случае гиалуроновая кислота.
Мы предлагаем метод изучения биологических функций белков во всей экрономической среде. Для того, чтобы исследовать способность этих молекул формировать свойства деления клеток внеклеточных матричных факторов. Для того, чтобы изучить, как это взаимодействие может быть почувствовать клетки, присутствующие в тканях окружающей среды, мы создали этот простой метод, в котором бинарные клетки, полученные из человеческих тканей было разрешено придерживаться C1q связаны с внеклеточной матрицы, в данном случае гиалуроновой кислоты.
Для процедуры покрытия первым шагом является связывание высокой молекулярной массы гиалуроновой кислоты с 96 хорошо ткани покрытием микроплюс. Для покрытия гиалуроновая кислота разбавляется в буфере углерода 0,1 моль PH 9.6 при концентрации 15 микрограмм на миллилитр. И нежно трубы реквихи для достижения однородного решения.
Для покрытия колодцев используются 100 микролитров раствора. Пластина затем передается при четырех градусах по Цельсию в одночасье. На следующий день вакуум аспирируют обработанные скважины.
Вымойте один раз с dPBS. Добавить либо C1q или BSA в соответствующих скважинах. C1q в настоящее время коммерчески доступен при концентрации одного миллиграмма на миллилитр и разбавляется при концентрации 25 микрограмм на миллилитр.
И dPBS, содержащий 0,5%BSA и 0,7 миллимолеса кальция и магния и дивалентных cations. BSA LPS бесплатно используется в концентрации 0,5% и дата PBF. Плита затем передается при четырех градусах по Цельсию на ночь.
C1q доза зависимых взаимодействий с иммобилизованной гиалуроновой кислоты определяется ферментом связаны иммуно SA. Ячейки маркировки с быстрым DiI. Липофильные трассировщик быстро DiI используется для обозначения клеток, представляющих интерес. Клетки, перерасходуемые в dPBS, используются при концентрации одного миллиона клеток на миллилитр.
Fast DiI разбавляется от одного до 100 непосредственно в клеточной подвеске. Подвеска клетки смешивается вручную и передается при 37 градусах по Цельсию в течение 15 минут. После пяти минут инкубации смешайте подвеску клетки и повторите эту операцию еще дважды.
Чтобы удалить избыток быстрого DiI, добавьте 10 миллилитров dPBS. Pivot осторожно вверх и вниз и центрифуги на 250 г в течение семи минут. Повторное увеличение клеточной гранулы в одном миллилитре эндофильной сыворотки человека свободной среды в присутствии 0,1%BSA.
Клетки адгезии на гиалуроновой кислоты C1q матрицы. Вакуумный аспират dPBS из колодцев с покрытием. Распределим 100 микролитров маркировки клеточной подвески на скважины с покрытием.
200 микролитров помеченных клеток разорены в эппендурной трубке, которая будет использоваться для стандартного генерации кривой. Инкубировать пластину в течение 35 минут при 37 градусах по Цельсию. Вынул тарелку из инкубатора.
Аккуратно аспирировать несбалансированные клетки. Вымойте один раз с dPBS содержащие 0,5%BSA и 0,7 миллимолеса кальция и магния. Lys адепт клеток, добавив 200 микролитров лиза буфера.
В то же время подготовить стандартную кривую на один-два серийного разбавления помеченных ячеек в буфере лиза. Выполните чтение сигнала флуоресценции на бесконечном приборе F 200 T-can, используя 544 нанометров в качестве восклицательные длины волны и 590 нанометров в качестве длины волны выбросов. Результаты представительов.
Как показали репрезентативные результаты, очевидно, что клеточное деление на гиалуроновой кислоте обнаружило, что C1q сильно усиливается по сравнению с только HA или HA связанным BSA. Процент адептов клеток на каждой матрице рассчитывается на основе стандартной кривой. Выводы. В наших экспериментах в первую очередь мы оценивали способность компонента дополнения C12 связывать внеклеточную матрицу в данном случае гиалуроновой кислотой с использованием арисального металла.
Во-вторых, мы проанализировали способность первичных клеток человека, окрашенных флуоресцентным красителем, преследовать связанную гиалуроновую кислоту. Модель, которую мы предложили в этом исследовании, является более легким и дешевым методом в качестве альтернативы 3D-модели внеклеточных матричных эшафотов для оценки этой клеточной реакции на сочетание стимулов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Это исследование исследует взаимодействие между компонентом C1q комплемента и гиалуроновой кислотой, сосредоточиваясь на том, как это взаимодействие влияет на адгезию клеток. C1q, провоспалительная молекула, значительно экспрессируется в микроокружении опухоли и плаценты.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Иммунология
Фон
- C1q является частью врожденной иммунной системы.
- Он высоко экспрессируется в определенных микроокружениях тканей.
- C1q взаимодействует с компонентами внеклеточной матрицы.
- Гиалуроновая кислота является ключевым компонентом внеклеточной матрицы.
Цель исследования
- Оценить роль C1q в адгезии клеток.
- Исследовать, как связанный с гиалуроновой кислотой C1q влияет на поведение клеток.
- Разработать метод для исследования взаимодействий белков во внеклеточной среде.
Используемые методы
- Были использованы бинарные клетки, полученные из человеческих тканей.
- Клеткам разрешили адгезию к C1q, связанному с гиалуроновой кислотой.
- Была установлена комплексная процедура для оценки.
- Биологические функции белков оценивались в контексте внеклеточной матрицы.
Основные результаты
- Взаимодействие между C1q и гиалуроновой кислотой способствует адгезии клеток.
- Клетки реагируют на наличие C1q во внеклеточной матрице.
- Этот метод предоставляет представление о свойствах деления клеток, на которые влияют внеклеточные факторы.
- Результаты могут иметь значения для понимания иммунных реакций в тканевых средах.
Выводы
- C1q играет значительную роль в адгезии клеток через его взаимодействие с гиалуроновой кислотой.
- Разработанный метод можно применять для дальнейшего исследования взаимодействий белков.
- Понимание этих взаимодействий может улучшить знания о функциях иммунной системы в различных тканях.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Understanding how complement protein C1q modulates extracellular matrix components like hyaluronic acid provides mechanistic insight into tumor-stroma interactions that drive adhesion-mediated progression. This assay enables early de-risking of targets involved in microenvironmental remodeling by quantifying how immune-derived signals alter matrix-dependent cell behavior. The method supports target validation in immuno-oncology by linking innate immune effectors to functional extracellular matrix changes relevant to metastatic competence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates how C1q binding to hyaluronic acid alters matrix properties to influence tumor cell adhesion, supporting functional target validation of microenvironmental mediators.
- Operational Value: Enables hypothesis testing of complement-driven matrix remodeling in a controlled, reproducible format using primary human tumor-derived cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence-based readouts of cell adhesion to C1q-HA matrices, enabling dose-response analysis of protein-matrix interactions.
- Operational Value: Uses a standardized 96-well coating protocol with defined concentrations of HA (15 µg/mL) and C1q (25 µg/mL) to ensure assay reproducibility across screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models how tumor-expressed C1q reshapes HA-mediated adhesion, offering a disease-relevant system to study stromal activation in neoplasia.
- Operational Value: Bridges discovery and preclinical work by providing a scalable method to evaluate matrix-targeted interventions using clinically relevant human cell inputs.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement to phenotypic screening, where matrix-dependent adhesion serves as a functional readout of pathway modulation in the tumor microenvironment.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by testing whether C1q-HA interaction drives pro-adhesive phenotypes in primary human tumor cells.
- Screening: Delivers standardized, quantitative adhesion outputs compatible with medium-throughput evaluation of modulators of protein-matrix binding.
- Analytics: Fluorescence signal quantification via standard curve enables precise comparison of adhesion conditions across HA, C1q-HA, and BSA-HA matrices.
- Translational Research: Uses human tumor-derived cells and physiologically relevant matrix components to enhance translational confidence in microenvironmental targeting strategies.
- Enterprise Reuse: Platform can be adapted to study other extracellular matrix proteins and immune mediators beyond C1q and HA, supporting cross-project standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in tumor-stroma communication by isolating the effect of C1q on HA-dependent adhesion.
- Operational Value: Defined coating and blocking steps (e.g., overnight 4°C incubation, dPBS washes) promote assay standardization and inter-lab reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by quantifying how immune matrix interactions influence early tumorigenic behaviors like anchorage-dependent growth.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets involved in complement-matrix crosstalk based on functional adhesion outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein coating, cell culture, and fluorescence-based quantification techniques.
- Dependent on access to fluorescence microplate readers capable of excitation at 544 nm and emission at 590 nm for fast DiI detection.
- Necessitates standardization of cell labeling protocols (e.g., fast DiI dilution, incubation times) to ensure consistent signal across experiments.
- Adaptation to other matrix proteins may require optimization of coating buffers and incubation conditions to maintain protein functionality.
- Limitations include reliance on 2D adhesion models, which may not fully capture 3D stromal complexity observed in vivo.
