Одноместный клеточной РНК последовательности нейронов дневно обозначенные мыши, с помощью ручной сортировки и двойной в Vitro транскрипция с абсолютной Счетчики виртуализации (дива Seq)

Этот метод может помочь решить ключевое препятствие в области одно нейронной изоляции и секвенирования. Такие, как сбор конкретной популяции или субпопуляции флуоресцентно помечены нейрона от пользователя определенных области мозга. Основным преимуществом этой техники является то, что она обеспечивает один нейрон интерес захвачен без загрязнения мусора.

Это также относительно нежный, что важно для хрупких типов нейронов, которые умирают быстро, когда подвергаются давлению жидкости обычной сортировки FACS. Начните с подготовки вытащил стекла микрокапилляры с 10 до 15 микрон выход диаметром с помощью капиллярного шкива. Используйте тонкие ножницы, чтобы сократить кончик капилляров, чтобы получить желаемый диаметр доски.

Затем используйте трубчатые разъемы, чтобы прикрепить 120-150-сантиметровую длину гибкой силиконовой трубки диаметром 0,8 миллиметра к мембранно-шприц-фильтру PVDF диаметром 0,2 микрона и двухмерный трубчатый клапан. Подготовка 500 миллилитров охлажденной искусственной спинномозговой жидкости или ACSF и оксигенации путем пузырьков 5%углекислого газа сбалансированного кислорода через Airstone в течение 15 минут или до тех пор, пока раствор очищает полностью. Приготовьте три 150-миллилитровых стакана, каждый из которых содержит 100 миллилитров ACSF.

С одной стороны, добавить коктейль деятельности блокаторы. С другой стороны, добавьте фракцию стрептококка для протеазы к окончательной концентрации одного миллиграмма на миллилитр. К окончательному стакану добавьте FBS к окончательной концентрации 1%и оксигенат с 5%carbon двуокиси сбалансированного кислорода через Airstone.

Наконец, сделайте три длинносырных пипетки Pasteur с уменьшением диаметров выхода, перекатив их на открытое пламя. Рассекайте мозг от усыпленной мыши, открыв череп небольшими ножницами и извлекая свежий мозг с помощью тонких типсов, не повреждая кору. Поместите мозг в охлажденный и оксигенированный ACSF, оставляя воздушный камень, прикрепленный к 5%углекислому газу, сбалансированному кислороду в течение всего периода секции.

Распорежьте мозг на виброме патрона и вырежьте корональные или стрельцовые секции толщиной 300 микрон. Соберите как можно больше секций, необходимых для получения как минимум от 10 до 50 помеченных ячеек. Положите ломтики на хлопчатобумажной сетки ломтик держатель помещен внутри стакана, чтобы они купались в кислородом ACSF.

Переместите ломтики в стакан, содержащий ACSF с блокаторами активности, и блокируйте в течение 15-20 минут при комнатной температуре при пузырьковом кислороде с помощью Airstone. Переместите ломтики в стакан, содержащий ACSF с раствором протеазы для выполнения мягкого пищеварения при комнатной температуре. После пищеварения вымойте протеазу, перемещая ломтики обратно в стакан, содержащий ACSF с раствором блокатора активности в течение пяти-десяти минут при комнатной температуре.

Держите восходящей кислорода. Затем приготовьте 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую ACSF с 1%FBS при комнатной температуре, и переместим отдельные секции в диск для микропересмешки. Под флуоресцентными вскрытиями, используйте пару тонких типсов для микро-препарации областей и слоев интереса, имеющих как минимум от 10 до 50 клеток.

Используя пипетку Pasteur, переместите микропарированные кусочки в 2-миллилитровую микроцентрифугную трубку, содержащую приблизительно 0,8 миллилитров 1%FBS в растворе ACSF. Титрат расчлененной ткани в микро-фуге трубки при комнатной температуре. Выполните около 10 ударов с каждым из воспаленных пипеток Pasteur, начиная с самой большой и заканчивая самым маленьким диаметром выхода.

Разпределить диссоциированные клетки в 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую кислородом ACSF и ждать пять-семь минут для клеток постепенно оседают. Наблюдайте за сигналом GFP и RFP под микроскопом вскрытия. Определите мусор, изучая морфологию при ярко-полевом освещении.

После того, как область клеток с небольшим количеством мусора была определена, использовать капилляры и прикрепить к трубам, чтобы забрать клетки, блокируя конец трубного клапана с языком. Затем распоить капилляр близко к клеткам. Отпустите блок на капилляре и быстро заблокив снова, чтобы захватить ячейку с помощью капиллярного действия.

Переместите капилляр в 100-миллиметровую чашку Петри со свежим кислородом ACSF и осторожно удар в трубку, наблюдая капиллярный кончик под флуоресцентной оптикой, чтобы обойтись клетки в блюдо. Повторите процедуру сбора до тех пор, пока не будут собраны от 100 до 150 ячеек, чтобы убедиться, что загрязняющие вещества, такие как мусор, минимальны в ярко-полевой дифференциальной интерференционной контрастной оптике. Наконец, используя свежий микро-капиллярный пипетку каждый раз, выберите одну ячейку и изгнать его в не более чем 0,5 микролитров в 0,2 микролитера микро-фуге трубки, содержащей один микролитер буфера сбора образцов с грунтовки.

Разбей наконечник пипетки в микро-фуге-трубке, чтобы убедиться, что ячейка остается в буфере сбора. Заморозить клетки, поставив трубки на сухой лед. Хранить в морозильной камере минус 80 градусов по Цельсию до обработки для усиления РНК.

ГАМК-нейроны были выделены из коры цигулета мозга мыши. РНК усиливается из вручную отсортированы нейроны варьировались от 200 до 4000 базовых пар в размере с пиковым распределением чуть выше 500 базовых пар. После очистки бисера библиотека cDNA еще больше ограничена вторым раундом очистки с использованием бисера для устранения фрагментов менее чем 200 базовых пар и для пика примерно в 350 базовых парах.

Секвенирование показало 4,8 раза от 10 до 5-й медианы или 6,9 раза от 10 до 5-го усредненного картографических считывания на ячейку. После дублирования удаления РНК с использованием UMIs, каждая ячейка имела 1,0 раза от 10 до 5-й медианы или 1,4 раза от 10 до 5-го среднего уникального чтения на ячейку. В консорциуме внешних РНК-элементов каждой клетки всплеск РНК использовался в качестве внутреннего контроля для расчета абсолютного количества молекул, добавленных в образец.

Наблюдалась линейная взаимосвязь входных данных с наблюдаемыми отсчетами со склоном 0,92 и скорректированным квадратом R 0,94. В среднем с помощью этой процедуры было обнаружено около 10 000 генов на одного нейрона, при этом более 95% одиночных клеток обнаружили более 6000 генов. После своего развития, этот метод проложил путь для молекулярных биологов, чтобы исследовать транскриптом различных хорошо охарактеризованных мыши корковых интернейронов, и определили отдельные категории генов, которые отвечают за кодирование клеточной идентичности.