Изоляция мыши Эпидермальных кератиноцитов и их в пробирке клоногенной культуры

Наш метод сбора эпидермальных клеток у взрослых мышей полезен для применения ниже по течению, таких как стволовые клетки кератиноцитов. Наша техника очень воспроизводится и может быть использована в сочетании с процедурами in vivo у мышей в контексте модели канцерогенеза кожи. После сбора образцов спинной кожи от усыпляемых взрослых мышей, используйте автоматические миппы и скальпель, чтобы поместить одну спинную кожу в то время, волосатые стороны вниз в тонкую чашку Петри и отказаться от подкожной ткани, включая жир из брюшной ткани кожи, пока ткань полупрозрачной.

Поместите царапины кожи в PBS до тех пор, пока все другие оставшиеся шкуры обрабатываются. Затем используйте скальпель, чтобы нарезать образцы кожи на 0,5 на 1,5 сантиметра полосы. Поместите полоски волосатые стороны вверх в стерильной чашке Петри перед плавающей образцы волосатые стороны на поверхности 20 миллилитров PBS плюс два х гентамицина раствор, дополненный 0,25%трипсина в пластиковых 100 на 20 миллиметров Петри блюдо в течение двух часов при 32 градусов по Цельсию.

В конце инкубации поместите стерильную, пластиковую, квадратную чашку Петри, содержащую 15 миллилитров среды сбора урожая на наклоне 30 градусов, и используйте изогнутые типсы, чтобы тщательно перенести плавающую полоску кожи в блюдо. Держа новое лезвие скальпеля под перпендикулярным углом к коже и используя достаточную, но не чрезмерную силу, откаблив эпидермис и волосы из образца в среду. Когда все полоски были Царапины, тщательно декант эпидермальной клетки, содержащие supernatant в стерильной 60 миллилитров банку, содержащую 1,5 дюйма магнитного перемешать бар и промыть чашку Петри с дополнительной среды сбора урожая для сбора оставшихся эпидермальных клеток.

Довнесите окончательный объем в банке до 30 миллилитров со свежей средой и перемешайте раствор эпидермальных клеток при 100 вращениях в минуту в течение 20 минут при комнатной температуре. В конце перемешивания инкубации в шкафу биобезопасности удалить перемешать бар и фильтровать клеточный раствор через 70 микрометровый ситечко в 50 миллилитров конической трубки. Используйте типсы, а затем пипетку, чтобы нажать волосы и слои роговицы материалов через ситечко манипулировать ткани, чтобы освободить захваченных волосковых клеток и использовать дополнительные пять миллилитров уборки среды, чтобы освободить остающиеся захваченных волосковых клеток в трубку.

Очень важно, чтобы эпидермальные клетки и волосы манипулировали, чтобы освободить клетки от волосяных фолликулов. Довнесите общий объем в трубке до 50 миллилитров со свежей средой и соберите клеточный фильтрат путем центрифугации. Resuspend гранулы в 5 миллилитров свежей среды сбора урожая примерно в 20 тритураций с 5 миллилитров пипетки.

Возьмите 0,5 миллилитров от одного до 20 разбавления и перенесите его в 2 миллилитровую трубку микрофуза. После тщательного смешивания образца возьмите 200 микролитров из трубки микротехи и аккуратно перемешайте с равным объемом 0,4%trypan синий раствор. Аккуратно смешайте этот раствор три раза и перенесите клетки на гемоцитометр для подсчета нуклеонированных кератиноцитов.

Оценка всех темно-синих клеток, как неприкосновенные клетки и оценка малых золотых и розоватых клеток в качестве жизнеспособных клеток. Жизнеспособность в среднем составляет около 80%, а окончательный выход кератиноцитов на мышь должен быть около 30 миллионов жизнеспособных клеток. После подсчета, собирать клетки с другой центрифугации, и для массовой культуры resuspend два-четыре раза от 10 до шестой жизнеспособной кератиноцитов на 35 миллиметров Петри блюдо в 2 миллилитров клеточной культуры среды.

Для анализа формирования клоногенной колонии, повторное использование клеток в один раз от 10 до третьего кератиноцитов на четыре миллилитров модифицированного Уильяма E Medium с добавками в концентрации сыворотки на коллаген покрытием 60 миллиметров Петри блюдо на рентгеновском облученных швейцарских мыши 3T3 фидер слоев. Для массовой культуры, расти культур на 32 градусов по Цельсию в 5%углекислого газа для соответствующего периода культуры клеток. Изменение среды через 24 часа после первоначального посева для массовой культуры и три раза в неделю после этого.

В конце клональной культуры аспирировать среды и исправить колоний в 10%buffered формалин в течение ночи при комнатной температуре. На следующее утро, пятно колоний с 0,5% родамина B в автоклавной воде в течение одного часа, прежде чем полоскания посуды в холодной автоматической воде, пока вода не протекает ясно. Затем наклонять посуду на крышках, чтобы высохнуть, прежде чем считать колонии.

Здесь показаны типичные результаты анализа образования кератиноцитов колонии после различных актуальных методов лечения. Стволовые клетки волосяного фолликула обычно составляют около 9% клеток, изолированных от взрослых C57BL/6 мыши спинной кожи, как оценивается потоком цитометрического окрашивания для маркеров стволовых клеток волосяного фолликула мыши. В этой цифре можно наблюдать характеристики роста колоний стволовых клеток кератиноцитов после культуры в четырех различных средних условиях.

После этой процедуры клетки могут быть использованы для цитометрии потока, флуоресценции активированной сортировки клеток, клеточной культуры и молекулярного биологического анализа. Этот метод позволил нам определить, что количество эпидермальных стволовых клеток является количественной и сложной чертой, ведущей к идентификации нового гена регулятивных стволовых клеток.