Определение последовательности зарождающейся вирусной ДНК одноцепочечной молекул во время ВИЧ-1 и 3'-Термини обратный транскрипции в инфицированных клетках

Этот новый метод анализа обратной транскрипции может рассказать нам новые вещи о области ретро вирусологии. Например, мы можем узнать о том, как работают факторы клеточных ограничений или как антиретровирусные препараты подавляют синтез ДНК HIV1. Основным преимуществом этого метода является то, что он не только предоставляет информацию о последовательности зарождающихся обратных транов, но и позволяет картографировать их точные 3-премьерные термины ДНК при одном ядерном плотном разрешении.

Обогащение ВИЧ1 бесплатных ДНК из оптовой ДНК ВИЧ1 инфицированных клеток, осуществляется путем гибридного захвата и должно осуществляться в рабочей станции ПЦР. Подготовьте мастер-микс магнитных стрептавидиновых бусин по трубе заголовок сто микролитров бисера на образец в одну микро центрифугу трубки место трубки на магнит подходит для микро центрифуг трубки. После того, как шарики улягостились в сторону магнита трубки, удалите буфер хранения, удалите трубку из магнита и повторно приостановите бисер в пятистах микролитров связующего буфера или буфера BW.

Поместите трубку обратно на магнит, ждать, пока шарики мигрировать в магнит, и удалить супернатант. Снимите трубку с магнита, добавьте пятьсот микролитров раствора кейсина, повторно приостановите бисер и инкубировать при комнатной температуре в течение десяти минут. Через десять минут вымойте бисер буфером BW.

Поместите трубку обратно на магнит, удалите супернатант и повторно приостановить бисер в пятьсот микролитров буфера BW. Добавьте пятьдесят пикомолов каждого захваченного биотинилированного олигонуклеотида на образец. Инкубировать при комнатной температуре во время качания в конце над концом смесителя в течение тридцати минут.

Затем верните трубку в магнит, удалите супернатант, удалите трубку из магнита, добавьте пятьсот микролитров буфера 1x ten и повторно приостановит бисер. После второй стирки повторно приостановить бисер с обездвиженными олигонуклеотидов в десяти микролитров 1x десять буфера на образец. Для каждого образца, этикетка одной микроцетрофуге трубки и добавить десять микролитров суспензии шарика, сто семьдесят микролитров ДНК, и девяносто микролитров 3x десять буфера.

Инкубировать в сухом тепловом блоке при девяносто двух градусах по Цельсию в течение двух минут, чтобы де-природы ДНК. Перемести трубы в другой сухой тепловой блок, который установлен до пятидесяти двух градусов по Цельсию, и инкубировать в течение одного часа. Каждые десять минут во время этой инкубации, инвертировать трубки для смешивания.

Когда один час инкубации будет сделано, мыть бисер один раз с пятью сотнями микролитров 1x десять буфера, и повторно приостановить в тридцать пять микролитров нуклеазы свободной воды. Убедитесь, что шарики хорошо оседают, оставляя трубки на магните в течение примерно трех минут, прежде чем удалить любую жидкость. Чтобы elute, инкубировать трубки при девяносто двух градусов по Цельсию в сухой тепловой блок в течение двух минут.

Затем быстро перемести трубки на магнит, по одной трубке за раз. После того, как шарики связаны с боковой частью трубки, перенесите супернатант, содержащий ДНК HIV1, в свежую трубку. Чтобы начать эту процедуру, повторно приостановить лиофилизированный адаптер на сто микромоляров в нуклеазы свободной воды и вихрь трубки.

На выборку, плюс один контрольный образец, объединяются ноль тока четыре пять микролитров буфера 10x T4 ДНК лигазы, четыре микролитров адаптера, и точка ноль пять микролитров нуклеазы свободной воды. Нагрейте до девяносто двух градусов по Цельсию в течение двух минут, а затем дайте ему остыть медленно до шестнадцати градусов по Цельсию в машине ПЦР. Это позволит адаптеру сформировать структуру волосяной булавки.

Ключевым шагом в этой процедуре является эффективная и непредвзятая перевязка адаптированных молекул для открытия 3-премьер-термини ДНК. Очищенные зарождающиеся молекулы кДНК различной длины привязана к одному адаптеру ДНК с помощью T4 dna ligase. Адаптер несет случайные шесть нуклеотидных штрих-кодов последовательности, что позволяет для парирования для облегчения перевязки, и одновременно служит идентификатором для уникальных читает.

3-премьер-адаптер termini несет в себе спейсер, чтобы предотвратить само перевязку. Чтобы создать шестьдесят микролитр окончательных реакций перевязки объема, добавьте следующее к каждой трубке ПЦР: шесть микролитров 10x T4 буфера перевязки ДНК, двадцать четыре микролитров сорок процентов PEG, шесть микролитров из пяти молар бетаин, четыре точки пять микролитров адаптера, одна точка два микролитера T4 ДНК лигазы, и восемнадцать точки теа микролитров ДНК. После смешивания реакций хорошо, инкубировать в машине ПЦР при шестнадцати градусах по Цельсию в одночасье.

На следующий день после перевязки адаптера, на тридцать микролитров формамида, содержащего буфер загрузки ДНК гель для каждой реакции перевязки и хорошо перемешать по трубе заголовок. Тепло в машине ПЦР при девяносто четыре градуса по Цельсию в течение двух минут, а затем сразу же положить на лед. Следующим шагом является подготовка к денатурации геля электрофорез.

Поместите недобросовной шесть процентов TBE денатурации полиакриламинид гель мочевины в соответствующий гель танк и добавить 1x TBE работает буфер. Предварительно запустите гель в течение двадцати минут. Далее, используйте шприц и двадцать один калибровочных иглы, чтобы вымыть гель карманы с бегущим буфером.

Затем загрузите тридцать микролитров на скважину одного и того же образца в три скважины. Рекомендуется запускать только один образец на гель, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Беги двадцать минут.

В то время как гель работает, подготовить три нулевой точки пять миллилитров микроцентрифуг трубки на образец с помощью двадцати одного калибра шприц иглы тыкать отверстия в нижней части. Вставьте каждую из подготовленных трубок в двухми миллилитровую трубку микро центрифуги и обозначите их именем образца плюс низкий, средний или высокий. Когда темно-синий краситель фронт составляет около половины пути через гель, остановить электрофорез и удалить гель кассеты.

Pry открыть кассету и вырезать гель вертикально с razorblade. Чтобы щедро акциз полосы с тремя колодцами загруженных образцов. Добавить гель полоса в контейнер с 1x TBE и пять микролитров циановой нуклеиновой кислоты пятна и инкубировать в течение трех-пяти минут.

Убедитесь, что окрашивания достаточно для того, чтобы легко определить верхнюю часть свободного адаптера, который должен быть удален позже. Затем тщательно очистите поверхность от синего светового трансиллюминатора дистиллированной деионизированной водой. Затем возьмите гель кусок из окрашивания контейнера и поместите его на световой ящик.

Включите световой ящик и осмотрите окрашенные нуклеиновые кислоты через оранжевый фильтр. Здесь показан репрезентативный образец ДНК на окрашенном геле. Адаптер обычно кажется перегруженным и работает как большая капля с перевязаной ДНК HIV1 работает выше, как полоса.

Красные линии указывают на участки гель должен быть сокращен, чтобы удалить свободный адаптер, и разделить образец на три части. Используя новый razorblade, отрежьте стороны геля если там зоны без пробы нагруженной все еще присутствуют. Далее, вырезать чуть выше адаптера, чтобы удалить адаптер и нижние части геля.

Наконец, отрезать очень верхней части геля в том числе около одного миллиметра гель карманы, которые часто имеют резкий интенсивный сигнал более высокого молекулярного веса ДНК. Разделите оставшийся кусок геля, содержащий образец горизонтально, на три ные части. Области низкого, среднего и высокого молекулярного веса.

Затем разрежьте каждый из трех фрагментов геля на две на два миллиметра и перенесите их в подготовленную нулевую точку пятимиллилитровые микроцентрифуговые трубки. Спин на высокой скорости с открытыми крышками в течение одной минуты. Чтобы сжать кусочки геля через отверстие в две миллилитровые трубки, чтобы создать гель слякоть.

Если частицы геля остаются в нижней части нулевой точки пятими миллилитровой трубки, перенесите их в двухми миллилитровую трубку вручную с помощью иглы. Начните процедуру извлечения ДНК, добавив один миллилитр буфера извлечения геля мочевины в гель слякоть в каждой микроцентрифуге трубки. Поверните трубки с конца над концом смесителя при комнатной температуре в течение как минимум трех часов.

Подготовь столбцы фильтра. Используйте чистый набор пинцета, чтобы добавить один небольшой фильтр круглого стеклянного волокна к каждой столбец центрифуги с целлюлозной ацетат мембраны фильтры, которая предотвращает засорение мембраны. Поставь фильтр на место с перевернутым кончиком головы трубы.

Кратко закрутить две миллилитровые трубки с гелеобразной слякотью и буфером экстракции в микроцентрифуге, а также перенести семьсот микролитров супернатанта в подготовленные фильтровые столбцы. Центрифуга фильтра столбцов в микроцентрифуге на высокой скорости в течение одной минуты. Затем перенесите поток в новую двухми миллилитровую микроцентрифугную трубку.

Перезагрузить столбцы с оставшимся супернатантом. Попробуйте получить как можно больше жидкости, как это возможно от экстракции слякоть и не беспокоиться, если гель штук включены. Снова закруться.

Объедините поток через те же образцы извлечения и продолжить, как описано в текстовом протоколе. Этот протокол использовался в образцах клеток CEMS-ST, инфицированных ВИЧ-1 с дефицитом Vif при отсутствии или наличии антиретровирусного человеческого белка A3G. Сюжет общего числа уникальных считывок, полученных из каждого образца, указывает на то, что повышение уровня A3G уменьшает общее число считыв.

Отражение ингибирующего эффекта A3G на обратную транскриптазу опосредованного синтеза cdna. В этих следующих трех участках, доля молекул на каждой возможной длины в течение первых ста восьмидесяти двух нуклеотидов, показана в синих гистограммах. Добавление A3G стоило резкого увеличения более коротких усеченных молекул cdna в нескольких очень специфических воспроизводимых положениях.

Пунктирной красные линии, показать процент читает проведение C до T мутаций в соответствующем положении. Положительный контроль может быть произведен путем обработки пул синтетических олигонуклеотидов знаю последовательности, длины и концентрации. Все молекулы должны появляться в почти равном изобилии с небольшими вариациями.

Если запуск библиотеки приводит к незначительному уклону длины, при секвенировании рекомендуется применить фактор нормализации, который вытекает из наклона, который представляет собой смещения размера. Эта процедура может быть легко адаптирована к другим системам, где определение трех основных концов молекул ДНК добавит ключевые идеи в Аусти метаболизма нуклеиновой кислоты. Пожалуйста, не забывайте, что работа с ВИЧ может быть чрезвычайно опасной, а некоторые инфекции следует проводить только в специально отведенных лабораториях безопасности.