Name: Свет driven молекулярные моторы на поверхностях для одного Молекулярное воображение (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Изучите синтез и иммобилизацию световых молекулярных моторов на кварцевых поверхностях для визуализации вращения на уровне отдельных молекул. Метод позволяет исследовать динамику искусственных молекулярных машин.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Эта работа была финансово поддержана Нидерландской организацией для научных исследований (НВО-CW), Европейский Совет исследований (ERC; расширенный Грант № 694345 B.L.F.) и Министерство образования, культуры и науки (гравитации программы нет. 024.001.035).

Примечание: Органического синтеза является основным ядром этого проекта. Рисунок 1 показывает основные шаги и как получить целевой молекулы.
1. Подготовка 1b
Примечание: Растворители были приобретены в чда.
<ol><li>
Синтез кетоновых (3) Примечание: Во-первых, пяти членов кольцо кетон 2 с группой Иодо функционализированных потому что это более реактивный. Эта реакция осуществляется в атмосфере аргона.<ol>
<li>В запечатанном тубы (100 мл) 2 (640 мг, 2,3 ммоль), Кюи (219 мг, 1,1 ммоль) и Най (3.44 g, 23 ммоль), добавить 1,4-диоксан (50 мл) и N, N'-диметил Этилендиамин (202 мг, 2,3 ммоль).</li>
		<li>Установите температуру реакции до 140 ° C и перемешайте за 24 ч.</li>
		<li>Охлаждать смесь до комнатной температуры (RT), Удаление растворителя в вакууме и очистить оставшийся материал флеш хромотографией: SiO2 (40 g); элюента: пентан: EtOAc = 10:1 (всего = 550 мл). Продукт должен быть получены как желтый, липкий нефти (642 мг, 91%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Синтез двигателя 5 Примечание: Используйте Бартон-Келлога реакции сформировать Центральный двойной связи. Эта реакция осуществляется под аргоном.<ol>
<li>В 50 мл раунд нижней колбе добавьте реагента (415 мг, 1,1 ммоль) в Lawesson, кетон 3 (219 мг, 0,68 ммоль) и толуол (10 мл).</li>
		<li>Нагрейте смесь обратным холодильником в течение 2 ч и впоследствии испарения растворителя.</li>
		<li>Очищают остатки флеш столбцу: SiO2 (24 g), элюента: пентан: Этилацетат = 30: 1 (всего = 155 мл) для получения соответствующих Тиокетоны, который впоследствии перерастворить в 20 мл ТГФ приносить синий решения.</li>
		<li>Добавьте ТГФ раствора (20 мл) диазо-соединение 4 (476 мг, 1.37 ммоль) синий решение и движение вновь смешанного решения при 50 ° C на ночь. Примечание: Это наиболее критический шаг всего синтеза. Диазо-соединение и Тиокетоны решение должны быть свежими и должны быть сделаны до реакции.</li>
		<li>Испарения растворителя и очистить остатки хромотографией: SiO2 (24 g), элюента: пентан: CH2Cl2 = 10:1 (всего = 220 мл) приносить мотор 5 (250 мг, 50%) как красный твердых.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Синтез мотора 6 Примечание: Когда формируется Центральный двойной связи, замените Иодо группы общие ацетилена.<ol>
<li>20 мл Шленк трубки, добавить 3 (165 мг, 0,26 ммоль), Pd (3ПРК)2Cl2 (2,5 моль %), Кюи (5 моль %). Затем, добавьте ТГФ (10 мл) и (i-Pr) NH (2 мл), который должен быть кипела аргоном за 10 мин до2.</li>
		<li>Перемешайте смесь в РТ за 10 мин. Затем добавьте triisopropylsilyl ацетилен (42 мг, 0,27 ммоль).</li>
		<li>Перемешать смесь на 15 h, а затем налить его в водный насыщенных NH4Cl раствор (25 мл).</li>
		<li>Распакуйте в смеси с CH2Cl2 (3 x 20 мл). Далее мыть комбинированных органических слоев с насыщенный рассол и сухой (Na2т-4).</li>
		<li>Удаление растворителя и очистить остатки флеш хромотографией: SiO2 (12 g), элюента: пентан: CH2Cl2 = 10:1 (220 мл) приносить 8 как коричневый масло (171 мг, 99%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Синтез мотора 8 Примечание: Эта реакция осуществляется под аргоном.<ol>
<li>Перемешать смесь 6 (161 мг, 0.24 ммоль), Пинаколиновая Эстер 7 (240 мг, 0.71 ммоль), K3PO4 (300 мг, 1,44 ммоль) и Pd (3ПРК)4 (98 мг, 0,096 ммоль) в 1, 4dioxane (20 мл) при 90 ° C в 50 мл Шленк трубка для 16 h.</li>
		<li>Охлаждать смесь RT, разбавляют этилацетат (30 мл) и выполнять фильтрацию с фильтром стекла.</li>
		<li>Удаление растворителя. Очистить остатки, флеш колоночной хроматографии: SiO2 (12 g), элюента: пентан: CH2Cl2= 1:6 (Всего = 122 мл) приносить эфира 8 как коричневый масло (156 мг, 56%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Синтез мотора 9
	<ol>
<li>Добавить TBAF (0,1 мл) в решение 8 (120 мг, 0,13 ммоль) в ТГФ (10 мл) в 20 мл Шленк трубки при 0 ° C.</li>
		<li>Перемешать смесь при 0 ° C в течение 1 ч, а затем налить его в водный насыщенных NH4Cl раствора (20 мл).</li>
		<li>После извлечения с КХКЛ3 (3 x 10 мл), мыть комбинированных органических слоев с насыщенный рассол и сухой (Na2т-4).</li>
		<li>Удаление растворителя и очистить остатки флеш хромотографией: SiO2 (12 g), элюента: пентан: Этилацетат = 1:3 (124 мл) приносить 9 как темно красного масла (116 мг, 95%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Синтез двигателя 12 Примечание: Эта реакция осуществляется под аргоном.<ol>
<li>20 мл Шленк трубки, добавьте мотор 9 (75 мг, 0.10 ммоль), PBI 11 (68 мг, 0.10 ммоль) Pd (3ПРК)2Cl2 (2,5 моль %), Кюи (5 моль %). Затем, добавьте ТГФ (10 мл) и (i-Pr) NH (2 мл), который должен быть кипела аргоном за 10 мин до2.</li>
		<li>Перемешать смесь на ночь и залить его в водный насыщенных NH4Cl решение.</li>
		<li>После извлечения с КХКЛ3 (3 x 20 мл), мыть комбинированных органических слоев с насыщенный рассол и сухой (Na2т-4).</li>
		<li>Удаление растворителя и очистить остатки флеш хромотографией: SiO2 (12 g), элюента: КХКЛ3 (100 мл) приносить мотор 12 как темно-красный твердых (66 мг, 57%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Синтез мотор 1b Примечание: Когда соединение эстера получается, гидролизуют это сделать молекулу конечная цель.<ol>
<li>Растворяют в 50 мл флакон Эстер 12 (90 мг, 0,038 ммоль) в ТГФ (5 мл) и метанола (5 мл), NaOH(собственн) (1 M, 5 мл) и Нагрейте смесь до 75 ° C для 16 h.</li>
		<li>Охлаждать смесь RT и добавьте 5 мл воды. Удалите ТГФ и метанола, роторный испарения.</li>
		<li>Титруйте смеси с HCl(собственн) (1 М) до достижения рН 1 сформировать коричневый осадок. Фильтрата смеси и мыть коричневого твердого тела с холодной водой (10 мл) и сухой в вакууме. Это коричневого твердого является целевой молекулы 1b (55 мг, 85%).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Подготовка мотор функционализированных монослоя MS-1b
<ol><li>Очистить кварц слайды, погружая их в растворе Пиранья (соотношение 3:7 30% H2O2 H2т4) на 90 ° C в течение 1 ч. Промойте обильно с вдвойне дистиллированной водой 3 x, затем промыть с метанола. Сухие слайды под поток N2 до модификации поверхности.</li>
	<li>Silanize кварц Пиранья очищены слайды, погружая в растворе 1 мм 3-аминопропил (diethoxy) метилсилан в свеже дистиллированной толуола в RT для 12 h. полоскания обильно с толуола и метанола.</li>
	<li>Sonicate кварц сначала в толуоле, затем в метанола и высушите их под струей аргона.</li>
	<li>Погружайте Амин покрытием слайды в растворе ДМФ 1b (10-4 М) на RT для 12 h.</li>
	<li>Вымойте слайды с ДМФ, воды и метанола, а затем высушить под струей аргона. После высыхания, слайды будут готовы для использования.</li>
</ol>

<ol><li>Berg, J. M., Tynoczko, J. L., Styer, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBerg%2C+JM+%22Biochemistry+5th+ed%22">Biochemistry 5th ed</a>. , W.H. Freeman. New York. (2006).</li>
<li>Erbas-Cakmak, S., Leigh, D. A., McTernan, C. T., Nussbaumer, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+Molecular+Machines%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Artificial Molecular Machines.</a> Chemical Reviews. 115, 10081-10206 (2015).</li>
<li>Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Art+of+Building+Small%3A+From+Molecular+Switches+to+Motors%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%3A+International+Edition%22%5BJournal%5D)">The Art of Building Small: From Molecular Switches to Motors.</a> Angewandte Chemie: International Edition. 56, 11059-11078 (2017).</li>
<li>Stoddart, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Machines%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular Machines.</a> Accounts of Chemical Research. 34, 410-411 (2001).</li>
<li>Kinbara, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+Intelligent+Molecular+Machines%3A+Directed+Motions+of+Biological+and+Artificial+Molecules+and+Assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Toward Intelligent Molecular Machines: Directed Motions of Biological and Artificial Molecules and Assemblies.</a> Chemical Reviews. 105, 1377-1400 (2005).</li>
<li>Kay, E. R., Leigh, D. A., Zerbetto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+Molecular+Motors+and+Mechanical+Machines%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%3A+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Synthetic Molecular Motors and Mechanical Machines.</a> Angewandte Chemie: International Edition. 46, 72-191 (2007).</li>
<li>Kottas, G. S., Clarke, I. L., Horinek, D., Michl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+Molecular+Rotors%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Artificial Molecular Rotors.</a> Chemical Reviews. 105, 1281-1376 (2005).</li>
<li>Watson, M. A., Cockroft, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Man-made+Molecular+Machines%3A+Membrane+Bound%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Man-made Molecular Machines: Membrane Bound.</a> Chemical Society Reviews. 45, 6118-6129 (2016).</li>
<li>Kassem, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+Molecular+Motors%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Artificial Molecular Motors.</a> Chemical Society Reviews. 46, 2592-2621 (2017).</li>
<li>Sauvage, J. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSauvage%2C+JP+%22Molecular+Machines+and+Motors%22">Molecular Machines and Motors</a>. , Springer. Berlin. (2001).</li>
<li>van Delden, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unidirectional+molecular+motor+on+a+gold+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Unidirectional molecular motor on a gold surface.</a> Nature. 437, 1337-1340 (2005).</li>
<li>Noji, H., Yasuda, R., Yoshida, M., Kinosita, K. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+the+rotation+of+F1-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct observation of the rotation of F1-ATPase.</a> Nature. 386, 299-302 (1997).</li>
<li>Hutchison, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+surface-bound+molecule+that+undergoes+optically+biased+Brownian+rotation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">A surface-bound molecule that undergoes optically biased Brownian rotation.</a> Nature Nanotechnology. 9, 131-136 (2014).</li>
<li>Krajnik, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defocused+Imaging+of+UV-Driven+Surface-Bound+Molecular+Motors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Defocused Imaging of UV-Driven Surface-Bound Molecular Motors.</a> Journal of the American Chemical Society. 139, 7156-7159 (2017).</li>
</ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Этот проект включает в себя значительное количество синтетических работ; Таким образом наиболее важным этапом является органический синтез к окончательной молекулы. Среди общего синтеза Бартон-Келлога реакция является ключевым шагом, так как это реакция, в которой формируется Центральный двойной связи молекулярные роторы. В настоящее время некоторые методы были использованы для формирования этих типов структур. Здесь используется диазо-Тиокетоны муфта, и верхняя и нижняя половины были подготовлены как диазо- и Тиокетоны соединений, соответственно. Тиокетоны и диазо-соединений, как правило, не стабильные по воздуху; Таким образом реакция требует быстрых действующих под строго инертной атмосфере.
Существующие методы ограничиться молекулярные моторы на поверхностях главным образом основаны на bipodal систем. Однако процессы изомеризации ранее разработанные bipodal моторы были препятствовали за счет межмолекулярных взаимодействий. Кроме того некоторые из bipodal примеров требует дальнейшего активации до вложения. Текущий метод выполняет это в tetrapodal манере, которая обеспечивает надежные крепления двигателя на поверхностях с достаточно изолированные пространства.
Ограничением этого метода является выбор флуоресцентные метки. Разрешены только красители с определенных длин волн, как вращение двигателя инициируется волны 365 Нм и таким образом не должно быть перекрываются. Кроме того синтетические маршрут, работающих в протоколе описаны к молекуле целевой требует несколько шагов, в которых суровые условия необходимы для завершения реакции. В будущем более снисходительный синтетическая конструкция вероятно необходима, если требуется более продвинутые молекулы для одного Молекулярное воображение.
В заключение дизайн и синтеза высоко функционализированных свет driven молекулярные роторы описан в первый раз. Обсуждаются некоторые детали синтетических усилий, а также. Кроме того демонстрируются методы графт мотор на поверхность кварца слайд, и образца могут быть далее протестированы для визуализации одного молекулярного движения14.

В живых организмах являются обильные молекулярные моторы, функционирования для поддержания ежедневной жизни. Они способны выполнять различные задачи, такие как производство топлива, транспорт, мобильность, и т.д.1. Опираясь на вдохновение эти увлекательные примеры в природе, ученые разработали серию Искусственные молекулярные моторы за последние несколько десятилетий для преобразования различных видов энергии в контролируемые движения на молекулярном уровне2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. три пионеров в этой области была присуждена Нобелевская премия по химии в 2016 году. Бен Feringa, одним из лауреатов, разработал свет driven молекулярные роторы, которая сможет пройти непрерывный однонаправленный вращательного движения.
Однако на молекулярном уровне, броуновское движение, также известный как случайные движения молекулярных столкновений и вибрации, обычно является главным препятствием для дальнейшего применения этих молекулярных моторов. Броуновское движение может нарушить любые направленное движение. Ограничиваясь молекулярные моторы на поверхности может быть одним из вариантов решения этой проблемы. Поступая таким образом, относительный угол поворота одной части молекулы в отношении другой преобразуется в абсолютный вращение ротора относительно поверхности11. Кроме того использование единого молекулярной визуализации техники может помочь визуализировать движения. Таким образом результаты этой работы помогут получить более глубокое представление синтетические молекулярные роторы.
Новаторская работа Есида и Kinosita (Рисунок 2a)12,13 служил источником вдохновения для дизайна в текущей работе, показано на рисунке 2b. В нижней половине свет driven молекулярные роторы прилагается к поверхности в качестве статора. Часть ротора функционализированных с жесткой руки и флуоресцентные метки. При применении двух различных облучения длинах волн к системе, один будет срабатывать вращения двигателя, в то время как другой будет волновать флуоресцентные метки. В принципе вращательное движение ротора часть вызывает вращение флуоресцентные группы. Таким образом вращение флуоресцентные метки может сопровождаться расфокусированные широкий поле флуоресцентной микроскопии. В первый раз, этот метод обеспечивает метод для преобразования относительное вращение молекулярные роторы в абсолютной вращения и, следовательно, способ визуализации вращения синтетических двигателя.
Эта статья содержит информацию по дизайн, полный синтез и решение изомеризации исследования Молекулярный двигатель, который используется для одного Молекулярное воображение. Молекулярная структура показана на рисунке 3. Кроме того описан метод, чтобы вложить молекулярные моторы на поверхности кварца.

<table><tbody><tr><td>ЯМР-спектрометр</td><td>Varian</td><td>AMX400</td><td>для исследования протонного ЯМР</td></tr><tr><td>Реагент для органических реакций Реагент для органических реакций</td><td>Sigma</td><td>аналитического класса</td><td>Реактив для органических реакций</td></tr><tr><td>Силикагель&nbsp;</td><td>Флэш-хроматография</td> <td>Merck</td><td>230-400 меш ASTM</td>&nbsp;</tr><tr><td>Растворитель</td><td>Acros</td><td>спектрофотометрический марк&nbsp;</td><td>Флэш-хроматография&nbsp;</td></tr><tr><td>УФ-лампа</td><td>ENB</td><td>280C</td><td>для УФ-видимого облучения</td></tr><tr><td>УФ-видимого абсорбционного спектрофотометра</td><td>JASCO</td><td>V-630&nbsp;</td><td>Измерение в УФ-видимом</td></tr></tbody></table> диапазоне

Свет driven молекулярные моторы на поверхностях для одного Молекулярное воображение

Light-driven Molecular Motors on Surfaces for Single Molecular Imaging

Демонстрируются дизайн и синтеза синтетических системы, которая направлена для прямой визуализации синтетических роторный мотор на уровне одной молекулы на поверхности. Эта работа требует тщательного проектирования, значительные усилия синтетических и надлежащего анализа. Вращательное движение молекулярные роторы в растворе показана 1H ЯМР и UV-vis методы спектроскопии поглощения. Кроме того описан метод графт мотор на Амин покрытием кварц. Этот метод позволяет получить более представление о молекулярных машин.

Облучение молекулярные роторы проводится с УФ света (λМакс = 365 Нм). После облучения фото индуцированной E-Z изомеризации вокруг центральной двойную связь происходит. В ходе этого процесса молекулы преобразуется из стабильной нестабильной изомер. Шаг спирали Термически активированные инверсии затем следует выпустить напряжение всей молекулы. Это приводит в исходное состояние стабильное. 1 H ЯМР спектроскопии затем используется для оценки процесса роторные (рис. 4a). Решение примера готовится в NMR трубки, то лампа УФ-света (λМакс = 365 Нм) находится рядом с метро. После 2 ч облучения можно найти различные изменения в спектре 1H ЯМР. Эти изменения указывают на поколение нового изомера, который считается нестабильной 1b (рис. 4В). Он рассматривается в 1H ЯМР спектроскопии, что H переходит от 2,9 ppm (Дуплет) до 3,3 ppm (двойной Дуплет). Сигнал на 1,4 ppm могут быть назначены как поглощение метильной группы, и он downfield переходит от 1,4 ppm до 1,6 млн. Когда образец хранится на ночь при комнатной температуре в темноте, оригинальные спектра могут быть восстановлены (рис. 4a). Это показывает процесс термической спирали инверсии, который преобразует нестабильной 1b стабильной 1b.
С целью изучения вращательное движение мотора 1b на поверхности, придает поверхности мотор сборки MS-1b (MS = двигатель на поверхностях) готовятся. Кварц слайды сначала функционализированных с Амин. После этого шага кварц погружен в раствор DMF (10-4 М) 1В на RT на ночь. Результирующая кварц промыть ДМФ, воды и метанола. Затем слайды подготовленный кварц принимаются УФ вид исследований. Спектр поглощения УФ вид MS-1B (сплошная линия) показано на рисунке 5b. Как видно в спектре, крупные поглощения группы и поглощения профиль близка к соотношению в растворе (Рисунок 5a). Она также показывает характерные поглощения для мотора (420 Нм) и PBI (456 Нм, 490 Нм, 524 Нм). Эти пики показывают успешное вложение мотор 1b Амин покрытием поверхностей. Кроме того кварц слайд облученного за 15 мин, и спектральные изменения наблюдаются аналогичные решения, указывающее поколение нестабильной MS-1b.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58750/58750fig1.jpg"> Рисунок 1 : Синтетическая схема подготовки целевых молекулы 1b. Схема показывает реагентов, растворителей и условий реакции, которые используются в каждом шаге.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58750/58750fig2.jpg"> Рисунок 2 : () схематическое изображение структуры F0F1-АТФазы, привитые на поверхности для визуализации однонаправленного вращения (воспроизводится с разрешения12). (b) концептуальный дизайн синтетические поверхности прыгните свет driven молекулярные роторы для одной молекулы воображения.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58750/58750fig3.jpg"> Рисунок 3 : Структура поверхности прыгните молекулярных мотор 1b, учитывая жесткую длинные руки между моторного ядра и PBI лейблом. 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58750/58750fig4.jpg"> Рисунок 4 : Алифатических региона 1 H-NMR спектров мотор 1В (CD2Cl2, -20 ° C, c = 10-3 M) () стабильный 1b, до облучения (365 Нм). (b) Фото стационарное состояние смеси после облучения. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58750/58750fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58750/58750fig5v2.jpg"> Рисунок 5 : Спектров поглощения УФ вид. Спектров поглощения УФ Вид () мотор 1b (CH2Cl2, 0 ° C), стабильного изомера (сплошная линия) и нестабильной изомера (пунктирная линия) в PSS. (b) MS-1b (кварц, 4 ° C) до (сплошная линия) и после облучения (пунктирная линия).

Рукопись описывает синтезировать и взяточничество молекулярные роторы на поверхностях для одного Молекулярное воображение.

The design and synthesis of a synthetic system that aims for the direct visualization of a synthetic rotary motor at the single molecule level on surfaces ...

Этот протокол является первым примером визуализации вращения человека светоемкого молекулярного двигателя на едином молекулярном уровне. Используемая здесь синтетическая техника предназначена для синтеза сложной молекулярной машины с несколькими функциональными группами. Во-первых, под атмосферу аргона поместите 640 миллиграммов соединения прекурсоров ротора два, 219 миллиграммов медного йодида и 3,44 грамма йодида натрия в 100-миллилитровую трубку Schlenk, оснащенную баром для перемешивания.Соедините запечатанную трубку с линией Шленка и добавьте 50 миллилитров 1, 4-диоксана и 263 миллиграмма транс-1, 2-diaminocyclohexane. Перемешать смесь при 140 градусах по Цельсию в течение 24 часов, чтобы обменять подстимост брома на йод. Затем дайте смеси остыть до комнатной температуры и испарите растворитель под вакуумом.Очистить соединение кремнезема гель флэш хроматографии и удалить летучие вещества для получения йода заменить соединение три, как липкое, желтое масло. Далее поместите 415 миллиграммов реагента Лоуссона и 219 миллиграммов соединения три в колбу Шленка, оснащенную баром для перемешивания. Соедините колбу с линией Шленка через конденсатор и очистите ее аргоном три раза.Добавить 10 миллилитров толуола и рефлюкс смеси в течение двух часов, чтобы преобразовать соединение три в тиокетон. Испарить растворитель и очистить тиокетон с помощью флэш хроматографии. Удалите летучие веществе из чистой фракции и растворите изолированный тиокетон в 20 миллилитров тетрагидрофурана.Затем растворите 476 миллиграммов свежеприготовленного соединения 4, которое является прекурсором статора диазо, в еще 20 миллилитров THF. Добавить раствор соединения 4 в раствор тиокетона и рефлюкс смеси под аргон в течение 16 часов, помешивая, чтобы сформировать двойную связь между ротором и статором. Испарить избыток растворителя, очистить сырой продукт флэш хроматографии, и удалить летучих веществ для получения моторного соединения 5 в качестве красного твердого тела.Затем добавьте 165 миллиграммов моторного 5, 4,56 миллиграмма биса (трифенилфосфина)хлорида палладия и 2,48 миллиграмма медного йодида в 20-миллилитровую трубку Schlenk, оснащенную батончиком. Запечатай трубку и соедините ее с линией Шленка. Смешайте 10 миллилитров THF и два миллилитров диизопропиламина и пузырькового аргона через смесь в течение 10 минут.Затем перенесите смесь в трубку Шленка и перемешайте реакционной смеси под аргон при комнатной температуре в течение 10 минут. Добавьте 42 миллиграмма триизопропилсилила ацетилена и продолжайте помешивать в течение 15-16 часов, чтобы заменить йод ацетиленом TIPS. Затем налейте смесь продукта в 25 миллилитров насыщенного аквея хлорида аммония.Извлекайте продукт в три 20-миллилитровые порции дихлорметана и вымойте комбинированные органические слои один раз 50 миллилитров насыщенного рассола. Высушите промытые органические слои над сульфатом натрия. Отфильтруть desiccant и удалить избыток растворителя.Очистить остатки флэш-хроматографии и удалить летучих веществ в вакууме, чтобы получить двигатель шесть, как коричневое масло. В 50-миллилитровой колбе, оснащенной батончиком для перемешивания, смешайте 90 миллиграммов двигателя с маркировкой PBI 12, пять миллилитров THF, пять миллилитров метанола и пять миллилитров одномярусного аксида натрия. Перемешать смесь при 70 градусах по Цельсию в течение шести часов, чтобы гидролизуйте эфиры на статоре.Затем охладить смесь до комнатной температуры, помешивая. Добавьте пять миллилитров воды вдвойне дистиллированной и удалите летучие растворители путем роторного испарения. Добавить aqueous однояролярной гидравлической кислоты, пока смесь не достигнет рН один, в этот момент двигатель 1b будет осаждать из раствора, как коричневый твердый.Восстановить твердые путем фильтрации, мыть его с 10 миллилитров прохладной воды и высушить его под вакуумом. Затем замочите кварцевые горки в растворе пираньи при 90 градусах по Цельсию в течение одного часа. Промыть горки с пятью миллилитров вдвойне дистиллированной воды три раза и с метанолом один раз.Высушите горки азотным газом. Затем приготовьте 1 миллимоляйный раствор 3-аминопропилового (диэтокси)метилсилана в свежедиллированном толуоле. Замочите слайды в этом растворе в течение 12 часов при комнатной температуре, а затем промыть силанизированные горки с пятью миллилитров каждый из толуола и метанола.Погрузите горки в толуол и метанол в последовательности по две минуты каждый, а затем высушите их под потоком аргонового газа. Далее приготовьте пять миллилитров 0,1-миллимолярный раствор двигателя 1b в диметилформамиде для каждого слайда. Замочите слайды в растворе 1b при комнатной температуре в течение 12 часов, чтобы функционализировать кварцевые поверхности с монослой 1b.Вымойте функциональные слайды с DMF, водой и метанолом в последовательности. Высушите горки аргоном и храните их в запечатанном контейнере под аргоном. Молекулярный двигатель 1b синтезировался в умеренной урожайности, с жесткой, фенил-этилен тетрамерной рукой, соединяющей ядро ротора с люминесцентным тегом.Спектр протонного ЯМР не показал существенной виквинальной связи между Ха и Хк, что согласуется с Ha и Hc оба в псевдоэкваториальной ориентации. Аксиальная экваториальная вицинальная связь наблюдалась между Hb и Hc.Irradiation с 365-нанометровым светом индуцированной изомеризации вокруг центральной двойной связи с этим нестабильным изомером. Сдвиг downfield метилового сигнала и развитие вицинальной связи между Ha и Hc оба указали, что метиловая группа была псевдоэкваториальной.Когда соединение держалось в темноте при комнатной температуре, термальная инверсия спирали выпустила нагрузку на молекулу с нафталином, проскальзывающим мимо фтора. Это вернуло молекулу в первоначальную конфигурацию из-за симметричного флюореола. УФ/визави спектроскопия стабильных и нестабильных изомеров показала скромные различия в характерных областях поглощения для жесткой руки и флуоресцентного тега.Успешная сборка монослой двигателя 1b на кварце была подтверждена УФ/визави спектроскопией. Монослой требовал всего 15 минут облучения, чтобы добраться до нестабильного изомера в фотостационарной обстановке. Важно, чтобы убедиться, диазо и тиокетон соединений свежеприготовленные для обеспечения успешного синтеза двигателя 5.Научно-исследовательская область молекулярных машин может извлечь выгоду из этого метода, так как она является важным ориентиром для проектирования, синтеза и визуализации сложных молекулярных машин. Решение Piranha используется для очистки слайдов. Это решение является высококислотным, и следует использовать с осторожностью.

light-driven-molecular-motors-on-surfaces-for-single-molecular-imaging

Research

JoVE Journal

Chemistry

Химия

В этой статье мы опишем, как мы получаем FRET следы от отдельных молекул ДНК, иммобилизованных на поверхности с помощью автоматизированной сканирующей конфокальной микроскопии.

Автоматизированная система для одной молекулы флуоресцентной Измерения поверхностного иммобилизованных биомолекул

Здесь мы описываем инструменты и методы обнаружения одиночных флуоресцентно меченных белковых молекул, взаимодействующих с одной молекулой ДНК, взвешенной между двумя оптически захваченными микросферами.

Сочетание Манипуляции одиночных молекул и визуализации по изучению взаимодействий белок-ДНК

Холост флуорофоры могут быть локализованы с нанометровой точностью, используя Фиона. Вот краткое изложение методики FIONA Сообщается, и как проводить Фиона эксперименты описывается.

Флуоресценции изображений с Один-нм Точность (Fiona)

Здесь показано приготовление функционализированных белком планарных стеклянных липидных бислоев, определение подвижности белка внутри и измерение плотности белка. Изложена дорожная карта создания микроскопа с полным внутренним отражением с пониженным шумом, который позволяет визуализировать одиночные двухслойные резидентные флуорохромы с высоким пространственно-временным разрешением.

Одной молекулы флуоресцентной микроскопии на Planar Поддерживаемые Бислои

Мы представляем протокол для создания фильма в реальном времени о молекулярном вращательном волновом пакете с использованием установки для визуализации кулоновского взрыва с высоким разрешением.

Прямая Визуализация лазерному сверхбыстрой вращения молекул

Мы представляем протокол для создания молекулярных челноки, где поверхность придерживается кинезин моторов белков продвинуть красителя, меченного микротрубочек. Слабого взаимодействия kinesins с поверхностью позволяет их реверсивные привязанность к нему. Это создает систему наноразмерных, которая exhibits динамической сборки и разборки его компонентов, сохраняя при этом свою функциональность.

Сборка молекулярной челноков, руководствовался обратимо придает Kinesins

Здесь представлена процедура экспрессии и очистки миозина 5а с последующим обсуждением его характеристики с использованием как ансамблевых, так и одиночных молекулярных флуоресцентных анализов in vitro на основе микроскопии, и как эти методы могут быть модифицированы для характеристики немузкулярного миозина 2b.

Миозин-специфические адаптации анализов подвижности на основе флуоресцентной микроскопии in vitro

Двунаправленный митотический кинезин-5 Cin8 накапливается в кластерах, которые расщепляются и сливаются во время их подвижности. Накопление в кластерах также изменяет скорость и направленность Cin8. Здесь описан протокол анализа подвижности с очищенным Cin8-GFP и анализа подвижных свойств отдельных молекул и кластеров Cin8.

Подвижность одиночных молекул и кластеров двунаправленного кинезина-5 Cin8, очищенного из клеток S. cerevisiae

В этом исследовании подробно описывается очистка KIF1A (1-393LZ), члена семейства кинезин-3, с использованием системы экспрессии Sf9-бакуловируса. Анализ одномолекулярного и многомоторного скольжения in vitro этих очищенных двигателей показал надежные свойства подвижности, сопоставимые с двигателями из лизата клеток млекопитающих. Таким образом, Sf9-бакуловирусная система поддается экспрессии и очистке интересующего моторного белка.

Одномолекулярный анализ очищенных сверхпроцессорных двигателей семейства кинезин-3 Sf9

Визуальная, одномолекулярная биохимия, изучаемая через микрофлюидные камеры, значительно облегчается с помощью стеклянной бочки, газонепроницаемых шприцев, стабильных соединений трубки с проточными клетками и устранения пузырьков путем размещения переключающих клапанов между шприцами и трубками. Протокол описывает двойные оптические ловушки, которые позволяют визуализировать транзакции ДНК и межмолекулярные взаимодействия.

Использование двойного оптического пинцета и микрофлюидики для исследований одной молекулы

В этой статье подробно описано, как создавать образцы для отслеживания одного белка в твердо поддерживаемых липидных бислоях. Это также объясняет простой флуоресцентный микроскоп с чувствительностью к одной молекуле и высокой частотой кадров. Наконец, мы описываем процедуру извлечения траекторий с одним белком.

Отслеживание отдельных белков в липидных бислоях с помощью флуоресцентной микроскопии

Изучите синтез и иммобилизацию световых молекулярных моторов на кварцевых поверхностях для визуализации вращения на уровне отдельных молекул. Метод позволяет исследовать динамику искусственных молекулярных машин.

Свет driven молекулярные моторы на поверхностях для одного Молекулярное воображение

Больше видео