Обнаружения эндотоксинов в нано составов с помощью анализов Lysate (Лал) Amoebocyte Limulus
30 января 2019 г.
Обнаружения эндотоксинов в инженерии наноматериалов представляет собой один из Гранд вызовы в области наномедицины. Здесь мы представляем тематическое исследование, которое описывает платформу, состоящий из трех различных форматов Лал оценить потенциальное загрязнение эндотоксина в наночастиц.
Этот метод может помочь ответить в медицинской области о безопасности нано лекарств. Преимущества этого метода является то, что он является стандартным, и используется во всем мире для оценки продуктов, нано лекарства. Демонстрация процедуры, будет Барри Нойн, на Nano технологии Характеристика лаборатории.
Для стандартной калибровки используется 900 микролитров лимулус-амибоцитов лизатата, или воды класса LAL. И 100 микролитров контрольного стандартного эндотоксина, чтобы подготовить как можно больше промежуточных разбавлений по мере необходимости, чтобы обеспечить подготовку стандарта калибровки с концентрацией одного эндотоксина единицы на миллилитр. Затем с помощью 900 микролитров воды класса LAL и 100 микролитров одного эндотоксина на миллилитр калибровки стандарта, подготовить второй стандарт калибровки, в концентрации 0,1 эндотоксина единицы на миллилитр.
Затем повторите серийное десятикратное разбавление, чтобы подготовить два более низких стандарта калибровки. Чтобы получить в общей сложности четыре стандарта калибровки, начиная от 0001 до одного эндотоксина единицы на миллилитр. Для подготовки 05 эндотоксин единицы на миллилитр контроля качества, сочетает в себе 50 микролитр одного эндотоксина единицы на миллилитр контрольного стандартного эндотоксина раствора, с 950 микролитров воды класса LAL.
Далее в программном обеспечении выберите настройки инструмента и создайте шаблон. Выберите сбор данных и введите тестовый идентификатор и группу данных в общей вкладке. Под аппаратной вкладкой выберите тип инструмента и метод LAL и убедитесь, что на экране появляется серийный номер, идентификатор системы и информация о серийном порту.
Нажмите хорошо два раза, чтобы подтвердить выбор инструмента, и связь с инструментом, и ввести образец ID в том же порядке, что образцы будут протестированы. Затем используйте кнопки по умолчанию, чтобы ввести стандартную кривую отрицательного управления и протестировать образцы. Добавьте соответствующий объем отрицательных стандартов калибровки контроля и контроля качества в дублирующие предварительно помеченные стеклянные трубки.
И добавить соответствующий объем LAL к первому тесту мерзкий. Vortex мерзкий кратко, и поместите флакон в соответствующие слоты испытаний в приборной карусели. Перед загрузкой образцов выполните несколько разбавления испытательного наноматериала в пределах максимально допустимого разбавления, как это было продемонстрировано.
Для подготовки 05 эндотоксин единицы на миллилитр контроля повышения ингибирования, объединить 25 микролитров одного эндотоксина единицы на миллилитр контрольного стандартного эндотоксина раствора, с 475 микролитров тест нано материала при данном разбавлении. После вихрей загрузите соответствующие элементы управления усовершенствования инноваций и неспикуювые образцы исследования в прибор. Затем aliquot unspiked и шипами нано материалов при определенном разбавлении в предварительно помеченных труб.
Перед вихрем, и загрузка в инструмент карусели. Для выполнения Гель-Клот LAL, подготовить контроль стандартный эндотоксин для окончательной концентрации четырех lambda, и объединить 100 микролитров стандарта, с 100 микролитров воды, или тестовый образец для достижения окончательной концентрации контроля стандартного эндотоксина два lambda. Добавьте 100 микролитров лизина к каждому разбавлению лямбды.
Vortex трубки кратко, и место стойки труб в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение одного часа. В конце инкубации, инвертировать трубы с плавным движением, и вручную записывать результаты, используя плюс для твердого сгустка, и минус для не сгусток, или свободный сгусток. В этом репрезентативном анализе, PEGylated липосомальный доксорубицин мешали хромогенного LAL при разбавлении пять, однако это вмешательство было преодолено при более высоких разбавлениях.
Восстановление Спайка было между 50 и 200%, когда формула была протестирована при разбавлении 50 и 500 в мутности и хромогенном LAL, а также при разбавлении пяти, в мутности LAL. При корректировке фактором разбавления, результаты были последовательны между заблуждениями в обоих эссе. Кроме того, результаты согласуются между тремя форматами эссе.
Помните, что каждый образец имеет свой собственный диапазон разбавлений, каждый формат LAL использует свой стандарт управления в доксином и лисаде, и что трубки, используемые для подготовки разбавления, и для выполнения реакции на различных для каждого эссе LAL. Для этой процедуры другие методы, такие как может быть выполнена, чтобы ответить на дополнительные вопросы о материале После его развития, этот метод проложил путь для швов и области нано медицины, для изучения медицинских применений нано-технологий, сформулированных препаратов в организме человека, и клинических моделей, включая, но не ограничиваясь не человеческих приматов, кроликов, собак и крыс. Не забывайте, что работа с доксином может быть чрезвычайно опасной и такие меры предосторожности, как ношение средства индивидуальной защиты, всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Данное исследование посвящено проблеме обнаружения эндотоксинов в искусственно созданных наноматериалах, что является критически важным вопросом в наномедицине. В работе представлена методика, использующая три различных формата ЛАЛ-теста для оценки потенциального загрязнения наночастиц эндотоксинами.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Наномедицина
- Определение эндотоксинов
- Оценка безопасности наночастиц
Теоретические сведения
- Эндотоксины могут представлять значительный риск при применении наноматериалов в медицине.
- Стандартные методы обнаружения эндотоксинов имеют решающее значение для обеспечения безопасности нанолекарств.
- Лизat амебоцитов Limulus (LAL) является широко используемым реагентом для тестирования на эндотоксины.
- Понимание уровня загрязнения наночастиц необходимо для соблюдения нормативных требований.
Цель исследования
- Разработать надежную основу для оценки загрязнения эндотоксинами в искусственно созданных наноматериалах.
- Продемонстрировать применение форматов LAL-тестов при оценке безопасности наночастиц.
- Предоставить исследователям в данной области стандартизированный метод.
Используемые методы
- Приготовление калибровочных стандартов с использованием LAL и контрольного стандартного эндотоксина.
- Создание промежуточных разведений для достижения необходимых концентраций.
- Демонстрация процедуры квалифицированным исследователем.
- Использование воды степени очистки LAL для обеспечения точности тестирования.
Основные результаты
- Разработанная платформа позволяет эффективно оценивать уровни эндотоксинов в наночастицах.
- Стандартизированные методы повышают надежность оценки безопасности.
- Демонстрация процедуры подтверждает ее применимость в реальных условиях.
- Результаты указывают на важность тщательного тестирования в наномедицине.
Выводы
- Данное исследование предлагает ценный подход к обнаружению эндотоксинов в наноматериалах.
- Стандартизированные методы тестирования имеют важное значение для повышения безопасности наномедицины.
- Необходимы дальнейшие исследования для совершенствования этих методов и обеспечения всесторонней оценки безопасности.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Определение содержания эндотоксинов является критически важным этапом контроля качества при разработке нанолекарственных препаратов, поскольку наноформуляции могут создавать помехи при проведении стандартных анализов и ставить под угрозу безопасность продукта. LAL-тест представляет собой стандартизированный, общепризнанный метод количественного определения загрязнения эндотоксинами лекарственных средств на основе наночастиц, вакцин и адъювантов. Надежное тестирование на эндотоксины обеспечивает соблюдение нормативных требований и снижает риски при переходе к доклиническим исследованиям за счет раннего выявления воспалительных опасностей на этапе разработки.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет оценивать профили безопасности наноматериалов путем выявления вызванных эндотоксинами воспалительных артефактов, которые могут исказить результаты исследований по валидации мишеней.
- Практическая ценность: предоставляет стандартизированный рабочий процесс для разграничения истинных фармакологических эффектов и ложноположительных результатов, опосредованных эндотоксинами, при первичном скрининге.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обеспечивает подготовку квалифицированных биологических систем для последующего скрининга путем подтверждения низкого уровня эндотоксинов в библиотеках соединений в наноформуляциях.
- Практическая ценность: Обеспечивает получение количественных, воспроизводимых результатов с использованием турбидиметрического, хромогенного и гель-коагуляционного форматов LAL-теста для стандартизации анализа и обеспечения сопоставимости данных между различными платформами.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Гарантирует, что системы, релевантные для заболевания, не подвержены воспалению, вызванному эндотоксинами, что обеспечивает снижение механистических рисков в трансляционных моделях.
- Операционная ценность: Способствует принятию обоснованных решений о продвижении проекта с учетом рисков за счет обеспечения согласованного количественного определения эндотоксинов в партиях материалов на этапах поиска, доклинических и клинических исследований.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Анализ LAL встраивается в континуум от разработки до доклинических исследований в качестве контрольной точки безопасности, которая следует за ранним синтезом наноматериалов и предшествует биологической оценке на моделях заболеваний.
- Биологические исследования: подтверждают, что наблюдаемая биологическая активность в анализах по валидации мишени не вызвана загрязнением эндотоксинами, что способствует проверке гипотез и уточнению путей передачи сигнала.
- Скрининг: обеспечивает стандартизированное измерение содержания эндотоксинов, что позволяет надежно оценивать соединения и отбирать перспективные хиты в библиотеках наноформуляций.
- Аналитика: позволяет получать количественные показатели единиц эндотоксина/мл с помощью трех форматов LAL-теста, что дает возможность сравнивать уровни загрязнения в различных формуляциях и сериях разведений.
- Трансляционные исследования: связывают оценку безопасности наноматериалов с преклиническим этапом, гарантируя, что исследуемые образцы соответствуют пороговым значениям эндотоксинов перед проведением исследований in vivo.
- Корпоративное повторное использование: создает универсальную платформу для тестирования на эндотоксины, применимую в различных проектах по наномедицине, разработке вакцин и адъювантов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность путем исключения эндотоксина как вмешивающейся переменной в фармакологических и иммунологических анализах.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость обнаружения эндотоксинов для различных форматов LAL-тестов и типов наноматериалов.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) за счет получения ранних данных по безопасности, что снижает вероятность неудач на поздних стадиях биологических испытаний и неэффективное использование капитала.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию наноформуляций на основе анализа рисков, опираясь на количественные профили эндотоксинов и показатели восстановления при добавлении стандарта (spike recovery).
Особенности реализации
- Требуется экспертными знаниями принципов анализа на эндотоксины, правил обращения с наноматериалами и стратегий минимизации интерференции.
- Необходимо наличие LAL-реагентов, калиброванного оборудования (например, микропланшетных ридеров, инкубаторов), а также воды и лабораторной посуды, не содержащих эндотоксинов.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов разведения, включение контролей (отрицательного, положительного, контроля ингибирования/усиления) и интерпретация результатов для турбиметрического, хромогенного и гель-клат методов.
- Необходимо учитывать особенности различных свойств наноматериалов (например, заряд, размер, химический состав поверхности), которые могут влиять на реактивность LAL и требовать индивидуального подбора диапазонов разведения.
- Существуют практические ограничения, такие как вызванная наночастицами интерференция анализа (усиление или ингибирование), которая должна быть устранена путем оптимизации разведения и контролей восстановления добавленного стандарта (spike recovery), как показано в исследовании.
