Липидного бислоя эксперименты с контактной пузырь бислоев для патч фиксаторы
16 января 2019 г.
Здесь мы представляем протокол для формирования липидных бислоев с помощью метода бислой контакт пузырь. Воду пузырь выдувается в среде органического растворителя, whereby монослоя образуется в интерфейсе вода масло. Два пипетки манипулируют для закрепления пузыри, чтобы сформировать бислоя.
Метод Contact Bubble Bilayer является альтернативным методом для обычных Lipid Bilayers. и этот метод позволяет более универсальную вибрацию через мембрану. Метод CBB интегрирует преимущества Planar Lipid Bilayer и метода зажима патчей.
По мере того как метод bilayer липидов CBB с произвольным составом липидов можно образовать. Мы разработали CBB для записи тока одного канала с высоким соотношением сигнала к шуму. Этот метод позволяет разновидности мембранных вибраций и предлагает обширную платформу типа к интерфейсу мембраны канала.
Каждый испытал дует мыльный пузырь. Аналогичные маневры принимаются для формирования CBB путем ручной тонкой настройки примененного давления, а не дует в рот. Практика и наслаждаться CBB.
К быть этой процедурой разгоняет фосфолипиды в хлороформе на пожеланную концентрацию в круглой колбе дна. Поместите раствор фосфолипида на вращающийся испаритель, подключенный к азотно-газового баллона. Поверните колбу под потоком азота при комнатной температуре до тех пор, пока не появится тонкая фосфолипидная пленка.
Затем поместите открытую колбу в децикатор, который подключен к вакуумной насосу. Использование вакуумного насоса аспирировать внутри децикатора в течение нескольких часов, чтобы удалить хлороформ тщательно. Впоследствии добавить соответствующий объем электролитного раствора в колбу и приостановить фосфолипид для получения двух миллигрм на миллилитр фосфолипидной суспензии.
Sonciate подвески в течение 20 до 30 секунд с помощью ванны sonicator для получения многослойной подвески пузырьков. Для приготовления протеолипосом, содержащих белки ионных каналов, добавьте белковый раствор в многослойную суспензию везикулы. И sonicate в течение нескольких секунд с помощью ванны sonicator.
Чтобы подготовить большие стеклянные пипетки, поместите стеклянный капилляр в пипетку шкив и изготовить микропипет с тонкой конические наконечник через два шага потянув. Затем установите микропипет на микро кузницу и свяжитесь с кончиком микропипета к платиновой нити на конические части диаметром от 30 до 50 микрометров. Нагрейте нить кратко и немедленно выключите ее.
Использование дистиллированной воды и этанола очистить поверхность стеклянной горки с мелкой хорошо. Затем нанесите силиконовый реагент на стеклянную горку и дайте реагенту полностью высохнуть в воздухе. Затем поместите стеклянную горку на сцену перевернутого микроскопа.
Добавьте 100 микролитров гексадекана в неглубокий колодец силиконовой стеклянной горки. С помощью трубчатого шприца заполните электролитный раствор до половины длины микропипета. Затем установите микропайпетт на держатель микропипюты с портом давления, что позволит электроду проволоки хлорида серебра/серебра замочить в растворе электролита пипетки.
Подключите один из держателей микропипеда к головной стадии усилителя зажима патча, а другой к электрической земле. Впоследствии подключите микроинъектор к порту давления держателя микропипюты. Отрегулируйте микропайпт в соответствующее положение над стадией перевернутого микроскопа с помощью микроманипулятора.
Чтобы отрегулировать потенциал смещения электрода, поместите один микролитер того же электролитного раствора, используемого для заполнения микропайпта на плоской поверхности вокруг мелкого колодец стеклянной горки для создания электролитного купола. Замочите кончик обоих микропипетов в электролитный купол. После этого отрегулируйте потенциал смещения электрода усилителя зажима патча.
Чтобы нарисовать липосомный раствор из кончика, добавьте один микролитер липосомного раствора на плоскую поверхность вокруг мелкого колодец слайд-стекла. Затем поместите кончик микропипета в липосому, содержащую купол. Аспирировать липосому, содержащую раствор с помощью микроинъектора.
Повторите процедуру для других mircopipette для аспирирующего канала восстановлены липосомы. Теперь поместите микропайп в гексадекан в мелководной колодец. Удар пузырь воды медленно, увеличивая давление, пока пузырь не достигнет желаемого размера и поддерживать такое же давление после этого.
Отбросьте пузырь, передавая кончик через масляный интерфейс воздуха, если трудно сохранить размер пузыря стабильным. Повторяйте процедуры до тех пор, пока не будут сформированы два стабильных пузыря. Установите контакт между двумя пузырьками.
Отладить давление, чтобы сохранить размер пузыря, потому что размер может постепенно меняться даже при постоянном внутри пузыря давления. Установите мембранный потенциал до нужного значения с помощью усилителя претензии патча и подождите появления тока канала. Для стабильного образования липидного билейера необходимо очистить пятна.
Стеклянные капилляры или пипетки препарат следует тщательно промыть и избежать загрязнения молекулами моющего средства. После того, как CBB сформировал молекулы канала либо в aqueous растворе или в липосоме были спонтанно вставлены в билейер в течение нескольких-десятков минут. Вставки каналов были подтверждены шагом мудрого увеличения текущей амплитуды под применяемый мембранный потенциал.
Двухслойный, образованный методом CBB, может быть разоблен на два монослоя. Ток канала pTB появился сразу после присоединения двух монослоев. И ток стал больше, как имеют контакт увеличил амплитуду тока был синхронизирован с отсоединения прикрепить манипуляции CBB.
Если количество выдува пузырьков увеличивает концентрацию липидов в аквозном растворе уменьшается и монослой не образуется. Затем попробуйте снять давление на липосомную секцию. После образования CBB и восстановления каналов вы можете попытаться варьировать составы аквозного раствора и мембраны с помощью изобилия или введения гидрофильных или гидрофобных веществ.
Метод CBB открыл универсальные способы изучения взаимодействия канала и мембраны.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен метод формирования липидных бислоев с помощью контактного пузырькового бислоя (Contact Bubble Bilayer, CBB), который является инновационной альтернативой традиционным методам. Данный метод обеспечивает возможность варьирования вибраций мембраны и позволяет регистрировать токи одиночных каналов с высоким соотношением сигнал/шум, что расширяет возможности изучения взаимодействий между каналом и мембраной.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биофизика
- Электрофизиология
- Технология липидных мембран
Теоретические основы
- Липидные бислои имеют жизненно важное значение для изучения мембранных белков.
- Традиционные методы имеют ограничения в гибкости и стабильности.
- Метод CBB сочетает в себе преимущества плоских липидных бислоев и методов локальной фиксации потенциала (patch clamp).
- Данный метод позволяет получать высококачественные записи активности ионных каналов.
Цель исследования
- Разработать надежный метод формирования липидного бислоя с использованием метода контактного пузырька.
- Обеспечить запись токов одиночного канала с улучшенным качеством.
- Изучить динамику мембран и взаимодействия между каналом и мембраной.
Используемые методы
- Метод CBB основан на контролируемом манипулировании пузырьками воды в органическом растворителе для создания бислоев.
- Фосфолипиды подготавливают и подвергают соникации для формирования многослойных везикул с последующим включением белков ионных каналов.
- Для точного нанесения и стабилизации пузырьков в процессе формирования бислоя изготавливают микропипетки.
- Экспериментальные установки включают усилители patch-clamp для мониторинга токов ионных каналов после формирования бислоя.
Основные результаты
- Метод CBB эффективно способствует встраиванию канальных белков в бислои, что подтверждается изменениями амплитуды тока.
- Были сформированы стабильные бислои, что продемонстрировало возможность регистрации токов одиночных каналов.
- Метод показал, что регулировка размера пузырька может влиять на стабильность мембраны и непрерывность тока.
Выводы
- Метод CBB представляет собой значительный прогресс в формировании липидных бислоев, открывая широкие возможности для применения в электрофизиологических исследованиях.
- Этот инновационный подход углубляет наше понимание динамики взаимодействия каналов и мембран.
- Полученные результаты подчеркивают возможность адаптации технологий липидных бислоев для различных экспериментальных условий.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Метод контактного пузырькового бислоя (CBB) решает одну из ключевых проблем в исследовании ионных каналов, обеспечивая высокую запись сигнала при низком уровне шума и позволяя точно контролировать липидный состав и механику мембраны. Эта возможность способствует снижению рисков при изучении механизмов действия терапевтических мишеней за счет уточнения взаимодействий между каналом и мембраной в физиологически значимых условиях. Данный метод повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска новых препаратов, предоставляя воспроизводимую платформу для функциональной валидации мишеней ионных каналов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем изучения функции ионных каналов в определенных липидных средах.
- Практическая ценность: обеспечивает функциональную валидацию мишеней посредством воспроизводимых измерений тока одиночного канала с низким уровнем электрического шума.
- Прогностическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет выяснения того, как липидный состав модулирует активность и стабильность каналов.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных систем липидных бислоев для последующего скрининга соединений путем включения липосом, в которые реконструированы каналы.
- Практическая ценность: Обеспечение стандартизации анализа за счет контролируемого образования пузырьков и последовательного обновления бислоя.
- Масштабируемость: Возможность повторного использования платформы за счет многократных циклов формирования и разрушения CBB.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает актуальность данных на всех этапах — от первичного открытия до доклинических исследований — за счет моделирования составов липидов, имеющих значение для конкретного заболевания.
- Снижение механистических рисков: позволяет оценить влияние нарушений структуры мембран на функцию каналов, что служит основой для прогнозов безопасности и эффективности.
- Соответствие биомаркерам: способствует выявлению липид-зависимых фенотипов каналов, которые могут коррелировать с клиническим ответом.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Метод CBB вписывается в континуум открытий — от валидации мишени до идентификации соединений-лидеров, предоставляя платформу с контролируемым содержанием липидов для характеристики ионных каналов перед скринингом соединений.
- Открывающая биология: Поддерживает проверку гипотез и выяснение путей передачи сигналов за счет возможности контролируемого изменения состава мембранных липидов.
- Скрининг: Обеспечивает готовность к проведению анализов благодаря воспроизводимому формированию бислоев и стабильному встраиванию ионных каналов.
- Аналитика: Обеспечивает количественные показатели тока через единичные каналы, что позволяет сравнивать поведение каналов при различных условиях.
- Трансляционные исследования: Связывают результаты с доклинической работой, позволяя изучать взаимодействия каналов с мембранами в липидных средах, имеющих значение при конкретных заболеваниях.
- Корпоративное повторное использование: Функционирует как возобновляемый ресурс, а не как одноразовый метод, что поддерживает его постоянное использование в различных проектах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности во взаимодействиях между каналом и мембраной.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и стандартизацию за счет контроля размера пузырьков и обновления бислоя.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), предоставляя надежные функциональные данные по мишеням-ионным каналам на ранних этапах поиска.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию программ по ионным каналам с учетом рисков на основе валидированной мембранозависимой активности.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с липидами, навыки в области электрофизиологии и микрофлюидного манипулирования.
- Необходимы патч-кламп усилители, вытягиватели стеклянных капилляров и микроинъекторы для формирования пузырьков и контроля давления.
- Требуется межкомандная стандартизация подготовки липидов, контроля размера пузырьков и протоколов очистки.
- При применении метода к различным типам ионных каналов или липидным смесям следует учитывать необходимость адаптации.
- Существуют практические ограничения, такие как необходимость тщательного контроля размера пузырьков и предотвращения загрязнения при подготовке пипеток.
