Журнал
/
/
Определение нормативных Т-клеток подмножеств в мышиных вилочковой железы, поджелудочной железы, дренаж лимфатических узлов и селезенки, с помощью проточной цитометрии
JoVE Journal
Иммунология и инфекции
Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove  Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
JoVE Journal Иммунология и инфекции
Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Определение нормативных Т-клеток подмножеств в мышиных вилочковой железы, поджелудочной железы, дренаж лимфатических узлов и селезенки, с помощью проточной цитометрии

English

Сгенерировано автоматически

11,113 Views

08:06 min

February 27, 2019

DOI:

08:06 min
February 27, 2019

21 Views
, , ,

ТРАНСКРИПТ

Automatically generated

Этот протокол помогает в расследовании роли иммунных клеток, в частности органов в здоровье и патологии. Основным преимуществом этого метода является то, что это экономически эффективный метод, так как это ручная техника. Демонстрация процедуры будет Чжэнкан Луо, аспирант из моей лаборатории.

Для начала поместите тимические железы и селезенки от ранее усыпленных мышей в 20 мл сцинтилляционных фиал, или 15 мл конических трубок, наполненных 5 мл сбалансированного соленого раствора Хэнка. Поместите дренажные лимфатические узлы поджелудочной железы в 1,5 мл микротрубок, наполненных 1 мл RPMI-1640. Убедитесь в том, чтобы использовать весь тимус и селезенки, и все PDLNs.

Держите органы на льду на протяжении всей процедуры. Используя ножницы, тщательно сжать тимуса и селезенки, чтобы освободить иммунные клетки. Откажитесь от оставшихся тимических и splenic капсул.

Перенесите подвеску клетки в коническую трубку 15 мл. Центрифуга в 433 раза г и при 4 градусах по Цельсию в течение пяти минут, и отбросить супернатант. Чтобы вынизыть эритроциты, повторно приостановить подвеску клетки в 5 мл хлорида аммония молара 0,2 моляра и инкубировать при комнатной температуре в течение десяти минут.

Переверните трубки осторожно каждые две минуты. В конце инкубации добавьте 5 мл HBSS, чтобы остановить лиз. Центрифуга труб в 433 раза г и при 4 градусах по Цельсию в течение пяти минут.

Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте клетки примерно в 5 мл HBSS. Затем заполните трубки HBSS. Повторите этот процесс, от центрифугирования образцов до заполнения трубки HBSS, один раз.

Центрифуга труб еще раз в 433 раза г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте гранулы в HBSS. Получить 5 мл круглых нижних трубок с крышками клеточного напряжения.

Перенесите 1 мл подвески тимических клеток и 500 микролитров подвески splenic cell в трубки, применив подвеску к крышкам клеточного напряжения. Во-первых, поместите 15 мл конической трубки в стойку. Поместите стерильную 250-метровую металлическую сетку над трубкой.

Промыть сетку 1 мл RPMI. Затем перенесите лимфатические узлы в металлическую сетку и используйте пару пинцетов, чтобы измельчить их через сетку. Нанесите 1 мл RPMI на сетку, чтобы промыть клетки в трубку.

Повторите этот процесс передачи и шлифования лимфатических узлов три раза для каждого образца, а затем удалите сетку. Центрифуга труб в 433 раза г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте клетки примерно в 5 мл RPMI.

Затем заполните трубки RPMI. Повторите этот процесс, от центрифугирования образцов до заполнения трубки RPMI, один раз. Центрифуга труб снова в 433 раза г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут.

Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте клеточные гранулы в 2 мл RPMI. Перенесите 2 мл клеточной суспензии в 5 мл трубок с круглым дном с крышками клеточного напряжения. Во-первых, центрифуга клеточной суспензии из образцов тимуса, селезенки и PDLN в 433 раза g и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут.

Откажитесь от супернатанта. Пятно клеток с поверхностными антителами, как указано в текстовом протоколе, и инкубировать трубки на льду в течение 40 минут. Затем добавьте 200 микролитров буфера FACS к каждой трубке.

Центрифуга в 433 раза г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут, и отбросить супернатант. Повторите этот процесс, добавляя буфер, центрифугирование и отбрасывая супернатант, один раз. Повторно приостанавливайте ячейку гранул в 500 микролитров буфера фиксации пермяки для фиксации и проницаемой ячейки.

Перенесите трубки в холодильник при четырех градусах по Цельсию на ночь. На следующий день центрифуга труб в 433 раза g и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте клеточные гранулы в 500 микролитров пермяки стирального буфера.

Центрифуга клетки снова в 433 раза г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут и отбросить супернатант. Пятно клеток с внутриклеточными антителами, как указано в текстовом протоколе. Инкубировать трубки на льду в течение 1 часа.

После этого добавьте в каждую трубку 500 микролитров пермяки стирального буфера. Центрифуга в 433 раза г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте гранулы в 500 микролитров пермяки стирального буфера.

Центрифуга еще раз в 433 раза г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте гранулы ячейки в 300 микролитров буфера FACS. Затем проанализируйте клетки на цитометре потока, как указано в текстовом протоколе.

В этом исследовании, одиночные клетки изолированы от тимических желез, PDLNs и селезенки нормальных гликемических мышей NOD, и окрашены маркерами клеток Treg, CD4, CD25, Foxp3, Helios, и нейропилин-1 для цитометрического анализа потока. Результаты анализируются и отображаются здесь в качестве репрезентативных стратегий закрытых. Доля Гелиос-положительных клеток среди CD4-положительных, CD8-отрицательных, CD25-положительных, Foxp3-положительных клеток Treg, как представляется, выше, чем у Nrp1-положительных клеток во всех трех органах.

Более 80% клеток Treg в тимусе, как видно, выражают Гелиос, который выше, чем в PDLN, и селезенки. Доля NrP1-положительных клеток среди Гелиос-положительных клеток Treg, как видно, выше в PDLN, чем в тимусе или селезенке. Большинство Nrp1-положительных клеток Treg также выражают Гелиос, и доля Гелиос-положительных клеток среди Nrp1 положительных клеток Treg, как видно, выше в тимусе и селезенке, чем в PDLN.

Вместе эти результаты показывают, что Гелиос является лучшим маркером для обнаружения Т Т трег клеток, чем Nrp1. Лимфатические узлы малы, но некоторые внутриклеточные маркеры требуют большого количества клеток, чтобы дать хороший сигнал в цитометрии потока. Другие методы не могут быть выполнены после этой процедуры, потому что клетки уже окрашены и мертвы.

Но четыре клеточных маркера животного могут быть заменены для изучения других типов иммунных клеток.

Резюме

Automatically generated

Здесь мы представляем протокол подготовить отдельные ячейки из мышиных вилочковой железы, поджелудочной дренаж лимфатических узлов и селезенки для дальнейшего изучения этих клеток с помощью проточной цитометрии. Кроме того этот протокол был использован для определения подмножества регулирующих Т-клеток с помощью проточной цитометрии.

Read Article