Микрофлюидика сопряжения с микроэлектродные массивы для изучения нейронные связи и распространения аксональное сигнала
December 8th, 2018
Этот протокол призван продемонстрировать как совместить в пробирке микроэлектродные массивы с microfluidic приборы для изучения потенциал действия передачи в нейрональных культур. Анализ данных, а именно определение и характеристика размножения потенциалы действия, выполненных с использованием новых передовых, но удобный и свободно доступны, вычислительные средства.
Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы продемонстрировать, как объединить использование микрофлюзики с микро электродными массивами для создания платформы, пригодной для изучения нейрональной связи и распространения аксонального сигнала. Здравствуйте, я Пауло Агиар, и я PI нейро-инженерии и вычислительной нейронауки лаборатории INEB, используется для кода для биомедицинской инженерии в Университете Порту, Португалия. Понимание передачи информации в нейро схемах остается одной из самых больших проблем в неврологии.
Сегодня я покажу вам, как мы можем объединить отдельные массивы микроактуаторов с микрожидкой жидкостью и программными инструментами, разработанными здесь, в нашей лаборатории, для обнаружения и характеристики распространяющихся потенциалов действий. Мы используем эту установку в различных исследованиях, а именно нейронного кодирования и декодирования, а также в связи между сенсорными нейронами и другими типами клеток. Мы считаем, что визуальная демонстрация этого протокола имеет решающее значение.
Поскольку сборка микрожидкых и микроэлектроразделов является трудностью в управлении и трудно воспроизвести только путем воспроизведения протоколов. Для рынка культовые продажи на этой платформе не просты, как обычные ABAs, и это требует особого внимания к ячейке сидя вещи, и культуры магнитов. Эта настройка позволяет нам изучать несколько связанных с коммуникацией свойств, таких как скорость распространения и направление, в хорошо контролируемой среде.
Хотя процедура записи проста, анализ данных требует знаний и использования правильных вычислительных инструментов. За день до заседания клетки начните с подготовки микрожидких устройств, очистите виниловой лентой. Аккуратно прижимайте ленту к устройству, чтобы достичь всех областей микрожидкой жидкости.
Воздушная плазма очищает MEA в течение трех минут, чтобы очистить поверхность и сделать ее более гидрофильной. Внутри ламинарного потока капот, погрузить микро жидкости в 70 процентов этанола. Дайте им высохнуть.
Поместите каждый MEA в чашку Петри, и стерилизовать на 15 минут воздействия УФ-излучения. Затем отправляйтесь в центральную область МЭА с 500 микролитров решения PEI. Инкубировать в течение по крайней мере одного часа.
Внутри ламинарного потока капот, аспирировать PEI покрытие раствор с поверхности MEA. Затем, мыть MEAs четыре раза с одним миллилитр стерильной воды. С помощью стерильного микроскопа, помещенного внутрь ламинарного капюшона потока.
Центр MEA чип, и добавить один миллилитр стерильной воды в центральной области MEA. Далее поместите микрожидкое устройство поверх поверхности МЕА и тщательно выровняйте микрогровую микро-активную сетку МЕА. Аспирировать чрезмерную воду, и инкубировать на ночь при 37 градусах, чтобы обеспечить полное вложение.
На следующий день загрузите колодцы ламинином и снова инкубировать. После сбора эмбрион susseds, приступить к префронтальной рассечения коры. Начните с тщательного разоблачения мозга, используя пару типсов.
Затем аккуратно удалить мозг из его полости. Обложка его с холодным H-HBSS. При присутствовали, удалить и отказаться от обонятельных луковиц.
Наконец, вскрыть префронтальной коры. Обеспечить полное удаление опола. Повторите эту процедуру для обоих полушарий.
Для количества мозгов, необходимых для вашего исследования. Внутри капота ламинарного потока соберите фрагменты коры, ранее расчлененные в общей сложности в пяти миллилитров H-HBSS. Затем перенесите эти фрагменты в стерильную 15 миллилитровую хроническую трубку.
Pipette, и 2,3 миллилитров свежеприготовленного трипсина раствор трубки, содержащей фрагменты коры. Смешайте подвеску и инкубировать при 37 градусах в течение 15 минут. Агитировать каждые пять минут.
Затем отбросьте супернатант, содержащий трипсин, добавьте H-HBSS, содержащий FBS, чтобы инактивировать оставшийся трипсин. Аккуратно агитировать. Пусть фрагменты коры оседают, и отказаться от супернатанта.
Вымойте два раза с H-HBSS, чтобы удалить FBS, и отказаться от супернатанта снова. Добавить дополненную нейронную базальную среду и механически разобщить ткани, медленно трубя вверх и вниз. Откажитесь от оставшейся ткани, фильтруя соленую суспензию через клеточный ситечко.
Затем смешайте 20 микролитров клеточной подвески с 20 микролитров трипан-синего цвета. Перенесите 10 микролитров в камеру Нойбауэра и подсчитайте количество жизнеспособных клеток. Непосредственно перед сидением клетки удалите ламинин из всех колодцев микро EF. Затем добавьте небольшой объем сверхнатантной среды к каждому колодец аксонального отсека.
Медленно посеять пять микролитров клеточной подвески в сомальный отсек. Инкубировать при 37 градусах в течение одного часа, чтобы клеточная привязанность к субстрату. Через час аккуратно заполните каждый колодец теплой дополненной средой.
Добавьте небольшие объемы, чтобы избежать отслоения клеток. Затем перенесите микро EF в инкубатор. Здесь показана культура на пять дней в пробирке.
Через неделю культуры начинают проявлять спонтанную активность. Перед выполнением записей, используйте контроллер температуры, чтобы съесть предварительно усилитель пожарной базы пластины. Затем поместите микро EF на преамплификатор, а затем закройте и защелкой крышку.
Для записи откройте многоканайное экспериментальное программное обеспечение. Установите скорость отбора проб до 20 килогерц. Перетащите фильтр и записанные коробки, и подключите их последовательно для записи как необработанных, так и фильтрованных данных.
Начните сбор данных, чтобы визуализировать сигналы и быстро записывать. Записанные данные можно быстро изучить с помощью многоканарового анализатора. Здесь распространение сигнала вдоль микрогров уже ясно.
Чтобы выявить и охарактеризовать эти события распространения, откройте запись в микро-охотнике за шипами. Нажмите кнопку информации о файле, чтобы получить доступ к настройкам записи, и выберите набор микро-электродов для анализа. Установите порог для распространения обнаружения событий.
И быстро читать данные. Программное обеспечение будет перечислять все обнаруженные последовательности. Пользователь может оценить скорость распространения как информацию, между парами микроэлектроприем, и на основе их между расстоянием и перекрестной корреляции.
Инструмент химио-графа позволяет пользователю вручную оценить скорость распространения. Здесь показано распространяемое событие. Обнаружено вдоль четырех микроэлектродов в микроросле.
Эти события могут быть представлены в сюжете Rasser. Вот распространяющаяся активность по 11 микросхемам за первые две минуты записи. Микрогровы высокой и низкой активности окрашены в желтый и красный цвета, с уважением.
Обратите внимание на синхронизацию активности вдоль 11 микрогров. Синхронизация не зависит от скорости активности. Как видно из вариаций мгновенной скорости стрельбы двух микрогров.
Микрогров также функционируют как аксональные усилители сигнала, как показано на участке коробки и усов. Мы показали вам, как сочетать микрофлекотики с MEAs, и как культура нейронов на них. Кроме того, как записывать и извлекать значимые данные из этих записей.
Мы надеемся, что эта демонстрация будет полезна для ваших исследований, почему вы, возможно, хотели изучить связь в нейронных цепях.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Этот протокол демонстрирует интеграцию микроэлектродных массивов с микрофлюидными устройствами для изучения передачи потенциалов действия в нейрональных культурах. Он подчеркивает важность визуальной демонстрации и использования удобного вычислительного инструмента для анализа данных.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Нейроинженерия
- Электрофизиология
Предпосылки
- Понимание передачи информации в нейронных цепях является основной задачей в нейронауке.
- Микроэлектродные массивы позволяют записывать электрическую активность нейронов.
- Микрофлюидные устройства обеспечивают точный контроль клеточной среды.
- Сочетание этих технологий может улучшить изучение нейронной связи.
Цель исследования
- Создать платформу для изучения нейронной связи и распространения аксональных сигналов.
- Обнаружить и охарактеризовать распространяющиеся потенциалы действия в нейрональных культурах.
- Способствовать исследованиям в области нейронного кодирования и декодирования.
Используемые методы
- Интеграция микроэлектродных массивов с микрофлюидными устройствами.
- Использование программных инструментов, разработанных для анализа данных.
- Визуальная демонстрация протокола для ясности.
- Применение в различных исследованиях, включающих чувственные нейроны.
Основные результаты
- Успешное обнаружение и описание потенциалов действия.
- Улучшенное понимание механизмов нейронной связи.
- Демонстрация эффективности протокола в исследовательских приложениях.
- Разработка удобного вычислительного инструмента для анализа данных.
Выводы
- Совместное использование микроэлектродных массивов и микрофлюидики эффективно для изучения нейронной активности.
- Этот подход может продвинуть исследования в области нейронауки и нейроинженерии.
- Визуальные протоколы важны для воспроизводимости и понимания.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This microfluidic-MEA platform addresses a key challenge in neuroscience drug discovery: isolating axonal signal propagation from somatic noise in neuronal cultures. By enabling high-resolution, long-term recording of spike propagation with improved signal-to-noise ratio, the method supports mechanistic de-risking of targets involved in neurodevelopment, neurodegeneration, and neuroregeneration. It provides predictive confidence in early discovery by quantifying communication-related phenotypes such as conduction velocity and firing patterns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating axonal signaling to clarify pathway-specific communication in neuronal circuits.
- Operational Value: Supports biological de-risking through functional validation of targets modulating spike propagation velocity and conduction failure.
- Predictive Value: Quantifies anterograde spike transmission and coding mechanisms to inform portfolio triage based on functional target engagement.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated, compartmentalized neuronal cultures for downstream compound evaluation with controlled axonal alignment and microelectrode coupling.
- Quantitative Outputs: Delivers reproducible, high-resolution measurements of propagation velocity, conduction failure, and firing rate for reliable compound screening.
- Scalability & Reuse: Enables platform standardization across studies of sensory neuron communication and co-culture configurations, supporting assay transferability.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models neurodevelopmental and neurodegenerative processes by tracking axonal signal propagation over weeks in vitro.
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation by quantifying communication phenotypes relevant to circuit dysfunction and repair.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions through objective metrics of neuroregenerative potential and information coding fidelity.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing functional readouts that bridge phenotypic screening and mechanistic validation in neuronal systems.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by isolating axonal contributions to network activity in controlled microenvironments.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible neuronal cultures with standardized electrophysiological readouts for compound effect evaluation.
- Analytics: Enables quantitative comparison of conditions via propagation velocity, conduction failure, and firing rate metrics derived from spike train analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling axonal communication dynamics relevant to neurodegeneration and neuroregeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying sensory neuron communication and co-culture systems across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in neuronal signal propagation.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through compartmentalized culture design and long-term stability.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets involved in circuit-based pathologies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantifiable axonal communication phenotypes linked to disease mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device handling, neuronal culture, and electrophysiological recording.
- Depends on access to microelectrode arrays, plasma cleaners, laminar flow hoods, and temperature-controlled recording systems.
- Necessitates cross-team standardization for consistent device alignment, cell seeding, and medium exchange protocols.
- Involves adaptation considerations when extending to different neuronal types or co-culture configurations beyond prefrontal cortex-derived cultures.
- Practical limitations include the technical complexity of microfluidic-MEA assembly and the need for specialized computational tools for spike propagation analysis.
