Изоляция, очищение, и дифференциация Остеокласт прекурсоров из костного мозга крысы

Этот метод имеет важное значение, поскольку он может быть использован для получения большого количества полностью дифференцированных остеокластов in vitro. Основным преимуществом этого метода является то, что он является более стабильным и безопасным и изолирует костный мозг за меньшее время и с меньшими усилиями по сравнению с традиционным производством. Этот метод может обеспечить стабильный источник остеокластов, которые являются важным объектом метаболических заболеваний костей, включая остеопороз, пародонтит и перипротетический остеолиз.

С незначительными изменениями, этот протокол также может быть подходящим для получения различных видов костного мозга, полученных клеток у крыс или других животных. Для начала поместите усыпляемых животных на дезинфицированную доску в положении лежа. Используя стерильные ножницы, сделать разрез примерно один сантиметр в длину на проксимальной бедренной кости, чтобы очистить кожу.

Далее, вскрыть бедренной кости и голени. Тщательно и осторожно, сократить двусторонние части соединения вокруг бедра, колена и голеностопного сустава, чтобы изолировать голени и бедренной кости. Отрежьте часть тканей вокруг кости, убедившись, что быть тщательным.

Затем поместите очищенные кости в блюдо с пятью миллилитров полной культуры среды. Используйте стерильные ножницы, чтобы отрезать длинную кость. Используйте одну миллилитровую шприц-иглу, чтобы тщательно промыть полость костного мозга 10 миллилитров полных средств массовой информации до тех пор, пока полость костного мозга не станет белой.

Перенесите эту клеточную подвеску в 50-миллилитровую трубку и процедите ее с помощью 70-метрового ситечко, чтобы удалить оставшуюся ткань. Добавьте пять миллилитров буфера красного лиза крови и инкубировать клетки на льду в течение восьми минут. После этого центрифуга клетки в 250 раз G в течение пяти минут, чтобы дать ячейки гранулы.

Аспирировать супернатант и повторное течение клеток в 10 миллилитров полного средства массовой информации. Используйте гемоцитометр для подсчета ячеек и расчета времени, затраченного на действия, предпринятые для этого метода. Во-первых, поместите усыпляемых животных на дезинфицированную доску в положении лежа.

Используя стерильные ножницы, сделать разрез примерно один сантиметр в длину на проксимальной бедренной кости, чтобы очистить кожу. Далее, вскрыть бедренной кости и голени. Отрежьте части тканей вокруг кости, хотя нет необходимости удалять ткани полностью.

Промыть голени и бедренной кости с 12 миллилитров PBS, а затем разрезать их пополам. Поместите snipped голени и бедренной кости в подготовленный один миллилитр пипетки кончик, и поместите это в подготовленную трубку микро центрифуги. Центрифуга трубки три раза при 1000 раз G и при четырех градусах по Цельсию в течение 45 секунд.

После этого удалите кончик пипетки, содержащий кость, из трубки, оставив костный мозг в трубке. Добавить 200 микролитров PBS в трубку, и пипетки вверх и вниз неоднократно распадаются костного мозга тщательно. Перенесите эту клеточную подвеску в 50-миллилитровую трубку и отфильтрув ее 70-микрометровым ситечком, чтобы удалить оставшиеся ткани.

Затем используйте гемоцитометр для подсчета ячеек и расчета времени, затраченных на шаги, предпринятые в этом разделе. Добавьте шесть миллилитров раствора разделения клеток в стерильную силико-центробежную трубку. Добавьте разбавленную клеточную суспензию в трубку.

После добавления подвески между слоем ячеек и раствором разделения появится четкий предел. Затем прилипать кончик пипетки к внутренней поверхности трубки под углом 45 градусов. Центрифуга слоистых раствора в горизонтальной центрифуге при 500 раз G в течение 30 минут.

После этого, аспирировать облачно второй слой, который содержит целевые клетки сверху вниз. Перенесите клетки-мишени в новую трубку. Добавить пять миллилитров PBS для мытья клеток, и центрифуга на 250 раз G в течение пяти минут.

Повторите этот процесс стирки, добавив PBS и центрифугирования в общей сложности три моет. Повторное высасывка клеточных гранул со средой индукции костного мозга. Используйте гемоцитометр для подсчета клеток.

Затем добавьте пять-восемь миллилитров индукционной среды костного мозга, чтобы получить окончательный раствор клеток в 300 000 клеток на миллилитр. Добавьте один миллилитр этого клеточного раствора к каждому колодец из 24 хорошо пластины. После инкубации клеток при 37 градусах по Цельсию в течение 24 часов, осторожно аспирировать от среды и добавить один миллилитр индукции остеокласта среды для каждой хорошо.

Аккуратно агитировать пластину и вернуть ее в инкубатор. Каждые 48 часов, удалить и заменить 0,8 миллилитров индуцции остеокласта среды из каждой хорошо. Агитировать пластину осторожно, прежде чем вернуть его в инкубатор.

Чтобы начать предварительное лечение костных ломтиков, используйте микроэлектровую пилу, чтобы разрезать свежую бедренную кору бедренной кости на два сантиметра толщиной ломтиками вдоль продольной оси. После резки и измельчения ломтиков, мыть ломтики, погружая их в стакан деионизированной воды и подвергая их ультразвуку на 100 герц в течение одного часа. Повторите этот процесс стирки три раза.

Погрузите вымытые ломтики в 75%-ный алкоголь в течение двух часов. Затем, аспирировать от алкоголя и подвергать каждый слайд ломтиков ультрафиолетового света в течение одного часа на чистой платформе. Чтобы начать toluidine голубое окрашивание, поместите предварительно обработанные кости ломтиками в колодцы 24 хорошо пластины.

После этого добавьте культурную среду в 24 хорошо пластины, чтобы погрузить кости ломтиками в течение двух часов. Завод и вызвать клетки, как поопродемонстрировано ранее. После остеокластов появились в четыре-шесть дней, мыть ломтики с одним миллилитр 0,25 молярного гидроксида аммония.

Sonicate ломтики три раза в течение пяти минут каждый, чтобы удалить живые клетки и для анализа ямы ресорбции на кости ломтиками. Затем удалите гидроксид аммония и испачкайте ломтики одним миллилитром 1%толуидинового синего раствора на ломтик в течение двух минут. Вымойте пятна ломтиками с PBS.

Случайным образом выберите пять представлений и используйте программное обеспечение для анализа изображений для выполнения полуколиченого анализа области ресорбции. Во-первых, префикс кости ломтиками с одним миллилитром 2,5%glutaraldehyde на ломтик в течение двух часов при комнатной температуре. Sonicate префиксированные ломтики три раза в течение трех минут каждый с одним молярным гидроксидом аммония, чтобы удалить клетки.

Затем удалите гидроксид аммония и трижды промыть ломтики костей с помощью PBS, при этом каждая стирка длится 12 минут. Исправить промывают кости ломтиками с 1%osmic кислоты в течение двух часов при комнатной температуре. Выполните обезвоживание градиента этанола, как указано в текстовом протоколе.

После этого замените этанол изоамил ацетат на 15 минут. Пальто ломтики с золотым палладием и анализировать их путем сканирования электронной микроскопии. В этом исследовании, большое количество прекурсоров остеокласта были изолированы, очищены и успешно индуцированных стать остеокластов.

Дополняя M-CSF и RANKL, гигантские остеокласты рассматриваются в дни пять-шесть. Формирование этих остеокластов успешно идентифицируется путем окрашивания ловушек. Большие и фиолетовые клетки считаются положительными клетками TRAP с несколькими ядрами.

С помощью этого метода, это типично для получения 800 остеокластов, содержащих до 30 ядер на остеокласта в 24 хорошо пластины. По сравнению с традиционным методом, этот улучшенный метод экономит около 20 минут в течение всего процесса изоляции. Использование костных ломтиков для оценки активности костной ресорбции является типичным методом in vitro.

Через толуйдин синий окрашивания, область резорбции визуализирована как светло-зеленый. Структуру и характеристики костных ям можно четко наблюдать путем сканирования электронной микроскопии. CTR, один из остеокластов конкретных маркеров клеток, имеет решающее значение для выявления остеокластов и изучения формирования остеокластов в кости.

Положительное выражение CTR четко определяет остеокласты и отличает их от макрофагов поликарионов. CTR четко указывается в иммунофлуоресценции анализы зеленого цвета, в то время как синий указывает на ядра клеток. Убедитесь в том, чтобы не перелом бедренной кости и голени, чтобы избежать потери костного мозга.

Человек, который никогда не выполнял этот метод раньше, может бороться при оказании помощи клеткам решение операции. Наконечник пипетки должен быть прилип к внутренней поверхности трубки и храниться под углом 45 градусов к внутренней поверхности.