Индукционной системы для кластерных устьиц на лечение погружения раствора сахара в проростках Arabidopsis thaliana
15 февраля 2019 г.
Цель настоящего Протокола заключается в демонстрации как побудить кластерных устьиц в семядоли Arabidopsis thaliana саженцев погружения лечение с раствором сахара содержащих средних и как соблюдать внутриклеточных структур, таких как хлоропласты и микротрубочек в кластерных гвардии ячейки, используя Конфокальная лазерная микроскопия.
Этот метод ответил на ключевой вопрос биологии развития растений. То есть, в чем важность пространственного распределения стоматы? Наша индукционная система кластерной стоматы с использованием раствора сахарозы довольно проста и непосредственно применима к трансгенным или мутантным линиям арабидопсиса талиана.
Для начала добавьте в стакан 1,1 грамма средних солей Мурашиге-Скуг и 15 граммов сахарозы. Добавьте в стакан 490 миллилитров дистиллированной воды и смешайте с баром для перемешивания. Используйте гидроксид калия для регулировки рН до 5,8.
Затем разбавить раствор 500 миллилитров дистиллированной воды и передать разбавленный раствор в средней бутылке. После этого, автоклав решения. Подготовь решение для стерилизации в соответствии с текстовым протоколом.
Затем, работая в асептических условиях, поместите около 50 трансгенных семян A.thaliana с флуоресцентным маркером в 1,5 миллилитровую трубку. Затем добавьте один миллилитр 70% этанола в трубку и перемешайте трубку пять раз. После того, как семена утонут на дно трубки, аккуратно удалите этанол с помощью микропипюты.
Добавьте один миллилитр раствора стерилизации в семена и инвертировать трубку пять раз, чтобы смешать. Аккуратно удалите раствор стерилизации из семян с помощью микропипеда. Затем добавьте один миллилитр стерильной воды.
Добавьте 1,5 миллилитров раствора Murashige-Skoog к каждому колодец из 24 пластин. Затем добавьте два стерилизованных семян к каждому хорошо. Используя два слоя парафильма, приклейте крышку к пластине.
Затем перенесите пластину в камеру роста, чтобы инкубировать в течение 14 дней. Во-первых, перенесите 30 микролитров раствора Мурашиге-Скуг из 24 хорошо пластины в центр стеклянной горки. Используя рассечение ножницами, удалите котилендон из 14-дневного рассады.
Поплавок cotyledon со стороной наблюдения лицом вверх на падение Murashige-Skoog решения. Подготовь котилендон в соответствии с методами, ранее описанными в журнале визуализированых экспериментов. Установите образец на сцене конфокального лазерного микроскопа.
Наконец, используйте яркое освещение поля для выбора кластерных охранных ячеек для наблюдения. В этом протоколе стоматальная кластеризация была индуцирована в саженцах A.thaliana. Кластерные клетки-охранники, выращенные в сахарозе, содержащей средние хлоропласты, чем клетки-охранники, выращенные в условиях, свободных от сахарозы.
Расширение хлоропластов было подтверждено хлоропластом стромы маркером и хлорофиллом аутофторесцентных средств, что свидетельствует о том, что лечение сахарозой привело к накоплению крахмала зерна в хлоропластах. Кроме того, конфокальные наблюдения GFP tub-6 показали, что корковые микротрубочные трубы были радиально ориентированы в обработанных сахарозой клетках, как и в клетках, свободных от сахарозы. На самом деле мы обнаружили этот метод случайно.
После находки мы изучили экологическую реакцию кластерной стоматы. Мы считаем, что наша система может помочь изучить значение распределения стоматы.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе демонстрируется способ индуцирования кластеризации устьиц в семядолях проростков Arabidopsis thaliana с использованием среды, содержащей сахар. Также описывается метод наблюдения за внутриклеточными структурами, такими как хлоропласты и микротрубочки в замыкающих клетках, с помощью конфокальной лазерной микроскопии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология развития растений
- Функционирование устьиц
- Методы микроскопии
Теоретические основы
- Устьица играют важную роль в газообмене и регуляции водного баланса у растений.
- Пространственное распределение устьиц влияет на физиологию и развитие растений.
- Arabidopsis thaliana является модельным организмом для изучения биологии растений.
- Конфокальная лазерная микроскопия позволяет детально наблюдать за клеточными структурами.
Цель исследования
- Для индуцирования кластеризации устьиц у проростков Arabidopsis thaliana.
- Для исследования внутриклеточных структур в замыкающих клетках.
- Для предоставления метода, применимого к трансгенным или мутантным линиям.
Используемые методы
- Приготовление сахарсодержащей среды с использованием солей Мурашиге-Скуга и сахарозы.
- Доведение pH до 5,8 с помощью гидроксида калия.
- Метод погружения проростков в приготовленную среду.
- Наблюдение за замыкающими клетками с помощью конфокальной лазерной микроскопии.
Основные результаты
- Успешная индукция скоплений устьиц в семядолях.
- Визуализация хлоропластов и микротрубочек в замыкающих клетках.
- Продемонстрированная применимость к различным линиям Arabidopsis.
- Полученные данные о пространственном распределении устьиц.
Выводы
- Данный метод эффективен для изучения развития устьиц.
- Он расширяет понимание функций устьиц у растений.
- Будущие исследования могут опираться на данный протокол для получения дополнительных данных.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Понимание пространственного распределения устьиц позволяет создавать прогностические модели эффективности использования воды и фотосинтетической способности растений, что имеет важное значение для оптимизации урожайности сельскохозяйственных культур и повышения их стрессоустойчивости в рамках сельскохозяйственных биотехнологий. Данная система индукции позволяет проводить механистический анализ биологии замыкающих клеток без генетической модификации, что способствует валидации мишеней в сигнальных путях растений. Описанный метод представляет собой масштабируемую и воспроизводимую платформу для оценки влияния соединений на паттерны распределения и функции устьиц в процессах поиска и разработки новых препаратов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет изучать механизмы пространственного распределения при развитии устьиц для подтверждения мишеней в сигнальных путях растений.
- Практическая ценность: предоставляет негенетическую, химически индуцируемую систему, применимую к трансгенным или мутантным линиям для снижения рисков при выборе мишеней.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает получение количественных фенотипических показателей (скученность устьиц, увеличение хлоропластов) для высокопроизводительного скрининга биоактивных соединений.
- Практическая ценность: использование стандартизированной среды MS с сахарозой и конфокального анализа гарантирует воспроизводимость анализа в разных лабораториях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: устанавливает связь между кластеризацией устьиц и внутриклеточными биомаркерами (размером хлоропластов, ориентацией микротрубочек) для механистического снижения рисков в исследованиях стрессовых ответов растений.
- Практическая ценность: обеспечивает преемственность этапов от поиска генов/мишеней до фенотипической валидации в системах, имеющих отношение к заболеваниям.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод подходит для рабочих процессов на ранних этапах поиска, где фенотипический скрининг и валидация мишени предшествуют идентификации ведущих соединений, что особенно актуально для конвейеров разработки агрохимикатов и признаков растений.
- Фундаментальная биология: позволяет проверить гипотезу о значимости расстояния между устьицами посредством индуцируемого кластеризации без генетических модификаций.
- Скрининг: обеспечивает создание готовых к анализу систем с количественно определяемыми фенотипами замыкающих клеток для скрининга библиотек соединений.
- Аналитика: предоставляет количественные данные конфокального анализа (размер хлоропластов, ориентация микротрубочек) для сравнения эффектов воздействия.
- Трансляционные исследования: связывает внутриклеточные наблюдения с функцией устьиц для прогностического моделирования ответа на стресс.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу индуцирования, применимую для различных мутантных и трансгенных линий Arabidopsis.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышение прогностической уверенности в валидации мишени посредством фенотипического снижения рисков механизмов формирования устьичного рисунка.
- Практическая ценность: Стандартизация за счет использования определенной среды sucrose-MS и регулирования pH обеспечивает воспроизводимость.
- Стратегическая ценность: Позволяет принимать ранние решения о целесообразности дальнейшей работы (go/no-go) с соединениями, влияющими на развитие устьиц, что снижает риск неудач на поздних стадиях.
- Влияние на портфель: Способствует приоритизации мишеней с учетом рисков на основе фенотипической валидации в системах с кластеризацией устьиц.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами тканей растений, влажными методами стерилизации и конфокальной микроскопией.
- Необходимо наличие автоклава, камер роста и лазерных сканирующих микроскопов.
- Необходима стандартизация процедур стерилизации семян и приготовления среды с сахарозой между исследовательскими группами.
- Адаптация метода для других видов или типов тканей может потребовать оптимизации концентрации сахарозы и продолжительности экспозиции.
- Метод ограничен наблюдаемыми фенотипами в семядолях; масштабирование до анализа всего растения может потребовать дополнительной валидации.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Title
0:31
Preparation of 3% Sucrose Containing 1/2 Murashige-Skoog Medium Solution
1:12
Induction of Clustered Stomata by Sucrose-containing Medium Solution Immersion Treatment
2:30
Microscopic Observation of Clustered Stomata
3:15
Stomata Clustering Induced in A. thaliana Seedlings
4:06
Conclusion
