Генная инженерия сапротрофные discoideum клетки на основе выбора и роста бактерий
25 января 2019 г.
Сапротрофные discoideum это организм популярная модель для изучения сложных клеточных процессов миграции клеток, эндоцитоза и развития. Полезность организма зависит от возможности генетической манипуляции. Здесь мы представляем методы для transfect сапротрофные discoideum клеток, которые позволяют преодолеть существующие ограничения культивирования клеток в жидких средах.
Ценность этого протокола заключается в том, что он позволяет практически любому штамму дискоида диктиостелия манипулировать молекулярной генетикой, независимо от того, будет ли этот штамм расти осечно в жидкой среде или нет. Другим преимуществом этой техники является то, что она быстрая и простая. Транспонировать к transfect клеткам с exochromosomal плазмидом перед начинать смешать dictyosteliums.
Результаты уже могут быть проверены через два дня после трансфекции с помощью микроскопии. Необычно работать с клетками диктиостелия и подвеской бактерий. Визуализация поможет дать экспериментаторам представление о том, как выполняются различные этапы протоколов.
Демонстрация процедуры со мной будет Soudabeh Imanikia, postdoc из моей лаборатории. Для начала приготовьте 1000 миллилитров буферного рабочего раствора соренсена с хлоридом магния и хлоридом кальция в соответствии с текстовым протоколом. После этого используйте одну колонию K аэрогенов для прививки одного литра ЛБ среды.
Позвольте бактериям расти в одночасье при 37 градусах по Цельсию при тряске. Спин клетки вниз в двух 500 миллилитров центрифуг трубки для сбора клеток. Затем, мыть бактерии один раз с 500 миллилитров буфера.
Переусердуйте гранулы в 20 миллилитров буфера. Используйте фотометр, чтобы проверить оптическую плотность образца и разбавить образец буфером до тех пор, пока оптическая плотность не будет около 100. После этого подготовьтесь к буферу электропорации H40 в соответствии с текстовым протоколом.
Расти K аэрогенов для слияния SM среды ночь при комнатной температуре. Добавьте 400 микролитров бактериальной суспензии в агарную пластину SM и равномерно распределив их. Затем возьмите стерильную петлю и привить ее клетками диктиостелия и распределить клетки на одном краю пластины.
Инкубировать пластину при 22 градусах по Цельсию в течение двух дней, чтобы зоны роста были достаточно большими для трансфекции. Добавьте 10 миллилитров подвески K aerogene в 10-сантиметровую ткань, обработанную культурой Петри. Затем используйте 10 микролитровую одноразовую петлю прививки, чтобы выскоблить клетки из зон роста культурной пластины.
Перенесите клетки в 1,5 миллилитровую трубку, содержащую ледяной буфер H40. Спин клетки в течение двух секунд при 10000 раз тяжести. Затем отбросьте супернатант и повторно посовекуйте клетки в буфере H40.
Затем добавьте 100 микролитров клеток в трубку, содержащую от одного до двух микрограммов ДНК. Pipette вверх и вниз, чтобы смешать и передать смесь ДНК клеток в предварительно охлажденной электропорации cuvette. Не добавляйте более двух микрограммов ДНК.
Более высокая концентрация ДНК токсична для клеток и снижает эффективность. После электропорации немедленно перенесите клетки в подготовленную 10-сантиметровую чашку Петри и дайте клеткам восстановиться в течение пяти часов. Чтобы выбрать трансфектант для нокаута, стук-в, или акт пять стук-в, отделить клетки от чашки Петри путем трубопроводов жидкости по поверхности.
Затем наймите три разбавления селективного агента в соответствии с текстовым протоколом. Наконец, распределить 150 микролитров подготовленных разбавлений в каждой колодец из 96-ну плоский дно ткани культуры пластин. В этом протоколе была продемонстрирована двухрепортовая экстрахромосомная плазмидная система.
Через 32 часа после трансфекции большинство клеток выразили оба флуоресцентных помеченных белками синтеза. Акт пять M вишни стук в и NC4 также была предпринята попытка. Две полосы были получены после запуска дайджеста на агарозный гель.
Базовая пара 4127 содержит нужную конструкцию. Очищенная ДНК использовалась для трансфекции клеток NC4. Два клона NC4 transfection были проанализированы с помощью ПЦР, и оба показали прогнозируемые модели полосы.
Затем для проверки результатов ПЦР использовалась южная помарка. NC4 рос быстрее на бактериальных газонах, чем клетки Ax2. Через четыре часа, больше клеток NC4 смогли ползти под агарозой, чем клетки Ax2.
Клетки NC4 были быстрее и показали более сильную химиотаксическую реакцию на фолат, чем клетки Ax2. Всегда используйте ячейки из свеженастроенных пластин SM. Никогда не используйте клетки старше четырех дней, в противном случае эффективность упадет.
Недавно изолированные, нексенические, белые штаммы HAP обычно используются для решения вопросов, касающихся ruching или социального поведения диктиостелия. Наша позволяет применять молекулярную генетику через эти изоляты.
Обзор
В данной статье представлен протокол трансфекции клеток Dictyostelium discoideum, позволяющий проводить генетические манипуляции независимо от условий роста конкретного штамма. Этот метод является эффективным и простым, что обеспечивает быструю валидацию результатов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Генетические манипуляции
- Модельные организмы
Теоретические сведения
- Dictyostelium discoideum является широко используемым модельным организмом для изучения клеточных процессов.
- Генетические манипуляции имеют решающее значение для исследования различных биологических вопросов.
- Существующие методы имеют ограничения, связанные с условиями роста различных штаммов.
- Данный протокол направлен на преодоление этих ограничений.
Цель исследования
- Предоставить надежный метод трансфекции различных штаммов Dictyostelium discoideum.
- Облегчить применение методов молекулярной генетики для штаммов, которые не растут аксенически.
- Продемонстрировать эффективность процесса трансфекции.
Используемые методы
- Приготовление бактериальных и буферных растворов для трансфекции.
- Электропорация клеток Dictyostelium discoideum плазмидной ДНК.
- Валидация результатов трансфекции с помощью микроскопии и ПЦР.
- Оценка поведения и роста клеток в ответ на трансфекцию.
Основные результаты
- Успешная трансфекция нескольких штаммов Dictyostelium discoideum.
- Экспрессия флуоресцентных белков наблюдалась через 32 часа после трансфекции.
- Клетки NC4 продемонстрировали более быстрый рост и более выраженный хемотаксический ответ по сравнению с клетками Ax2.
- Подтверждение генетических модификаций с помощью ПЦР и Саузерн-блот-анализа.
Выводы
- Данный протокол позволяет эффективно проводить генетические манипуляции со штаммами Dictyostelium discoideum.
- Он создает основу для будущих исследований клеточного поведения и генетики.
- Наилучшие результаты по эффективности трансфекции обеспечивают свежевыделенные штаммы.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данный протокол позволяет осуществлять генетические манипуляции со штаммами Dictyostelium дикого типа, растущими на бактериях, что позволяет преодолеть ограничения штаммов, адаптированных к аксеническому культивированию, с нарушенной Ras-сигнализацией. Он представляет собой масштабируемый и быстрый метод валидации мишеней в релевантной для заболевания модельной системе, что способствует снижению механистических рисков на ранних этапах поиска. Этот подход распространяет методы молекулярной генетики на штаммы, изолированные из природной среды, повышая трансляционную преемственность и прогностическую достоверность рабочих процессов фенотипического скрининга.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы в ненарушенных путях передачи сигналов и моторики, используя неаксенические штаммы с сохранным Ras-сигналингом.
- Практическая ценность: снижает вероятность экспериментальных ошибок, вызванных дефектами макропиноцитоза и нарушениями миграции, которые наблюдаются у аксенических штаммов.
- Прогностическая ценность: способствует функциональной валидации мишеней и снижению биологических рисков за счет возможности проведения мутагенеза в физиологически релевантных условиях культивирования.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать рекомбинантные клетки, экспрессирующие двойные флуоресцентные репортеры, в течение 32 часов, что обеспечивает быстрый считываемый результат анализа для скрининга соединений.
- Практическая ценность: Стандартизирует рабочий процесс трансфекции с использованием бактериальных газонов и электропорации, что повышает воспроизводимость результатов в различных лабораториях.
- Масштабируемость: Сокращает сроки от трансфекции до получения валидированных клонов с недель до дней, поддерживая высокопроизводительную инженерию штаммов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: способствует изучению хемотаксиса и социального поведения в свежевыделенных штаммах дикого типа, что повышает релевантность моделей заболеваний.
- Практическая ценность: позволяет напрямую применять методы молекулярной генетики к изолятам из окружающей среды без предварительной аксенической адаптации.
- Трансляционная преемственность: связывает валидацию мишеней на этапе открытия с доклиническими фенотипами с помощью измеримых показателей, таких как хемотаксис, индуцированный фолатом, и тесты на проникновение через агарозу.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод применим на этапах от раннего поиска до идентификации соединений-лидеров, поскольку он позволяет создавать генетически модифицируемые модели для анализа сигнальных путей и фенотипического скрининга.
- Открывающая биология: Обеспечивает проверку гипотез в области хемотаксиса, макропиноцитоза и сигнальных путей развития с использованием интактных штаммов дикого типа.
- Скрининг: Предоставляет количественные данные флуоресценции и роста бактериальных газонов для надежной оценки соединений.
- Аналитика: Позволяет проводить ПЦР, Саузерн-блоттинг и микроскопическую валидацию генетических модификаций в течение 32–48 часов после трансфекции.
- Трансляционные исследования: Связывает генетические манипуляции с функциональными тестами, такими как хемотаксис и рост под агарозой, что позволяет принимать обоснованные решения о дальнейшем продвижении проекта с учетом рисков.
- Корпоративное повторное использование: Создает универсальную платформу для инженерии любого штамма Dictyostelium, независимо от источника изоляции или условий культивирования.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов за счет устранения артефактов аксенической адаптации и восстановления нативных сигнальных путей.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость благодаря стандартизации приготовления буферов, параметров электропорации и протоколов селекции.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала за счет сокращения сроков инженерии штаммов и обеспечения возможности быстрого принятия решений «да/нет» при валидации мишеней.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию с учетом рисков за счет создания механистически обоснованных моделей с валидированными генетическими модификациями.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области микробиологии для подготовки бактериальных культур и работы с Dictyostelium на бактериальных газонах.
- Необходим доступ к оборудованию для электропорации и стерильной инфраструктуре для культивирования тканей для проведения этапов трансфекции и восстановления.
- Необходима стандартизация плотности бактериального инокулята (OD ~100) и приготовления буфера H40 для всех пользователей.
- Требуется адаптация протокола при его применении к различным изолятам дикого типа или экологическим штаммам.
- Метод ограничен штаммами, способными расти на бактериальных газонах; эффективность снижается при использовании клеток старше четырех дней после изоляции.
