Приложения пространственно временных карт и методы анализа частиц для количественного определения внутриклеточных Ca2 + сигнализации в Situ
January 7th, 2019
Генетически закодированный Ca2 + показателей (GECIs) радикально изменили как на месте Ca2 + изображения производится. Для максимального восстановления данных от таких записей, необходим соответствующий анализ Ca2 + сигналов. Протоколы в настоящем документе облегчить количественную оценку Ca2 + сигналов, записанная на месте с помощью пространственно-временных сопоставления и анализа на основе частиц.
Способность приобретать большие объемы данных в ходе экспериментов по визуализации кальция значительно улучшилась, особенно в ходе экспериментов по визуализации тканей. Наши протоколы описывают соответствующие методы анализа для количественной оценки и описания этих наборов данных. Наши протоколы генерируют целый ряд пространственных, временных и интенсивности значений, которые присущи сигнализации кальция в целых тканях, и это может быть потеряно в более элементарном анализе.
За час до передачи изображения тонкой кишки, собранной из мыши с интерстициальными клетками Cajal или ICC, которые специально выражают генетически закодированный индикатор кальция на стадию вращающегося конфокального микроскопа диска. И непрерывно пронизывают ткани с 37 градусов по Цельсию Кребс-Рингер бикарбонат или KRB раствор. С помощью увеличения от 60 до 100 X найдите stellate-образное миентическое сплетение ICC или ICC-MY между круговыми и продольными гладкими мышечными слоями тонкой кишки.
Затем найдите шпиндель-образное глубокое мышечное сплетение ICC или ICC-DMP в одной плоскости между круглым гладким мышечным слоем и подмукозаным сплетением и сохраните фильмы в качестве стопки изображений TIFF. Для создания spatiotemporal карты или STMs активности кальция ICC-DMP открыть стек изображения в ImageJ, и нажмите Изображение, Тип и 32-битный изменить качество изображения. Чтобы создать сканирование строки, нажмите правой кнопкой мыши на инструмент выбора строки и выберите сегментированную линию.
Используя одиночные левые щелчки, провести линию вдоль среднего доступа отдельного ICC-DMP, дважды нажав, когда вся ячейка была изложена. Выберите изображение, стеки и reslice. Появится всплывающее окно.
Выберите Поверните на 90 градусов, чтобы сориентировать сканирование линии слева направо, чтобы его можно было откалибровать и прочитать со временем на х-оси с пространством на оси и нажмите OK. Появится spatiotemporal карта. Чтобы точно измерить амплитуду сигналов кальция с карты, выберите прямоугольный выбор и нарисуйте область интереса вокруг области в STM, которая отображает наиболее равномерной и наименее интенсивной области флуоресценции. Нажмите Анализ и Гистограмма, чтобы получить среднее значение интенсивности в выбранной области интереса и нажмите Редактировать, Выбор, Выберите все, чтобы выбрать весь STM.
Далее нажмите Process, Math and Divide и введите среднее значение интенсивности с выбранной областью STM, представляющим интерес для всплывающего окна. STM почернеет. Исправь это, нажав изображение, настроить, яркость / контрастность, и авто во всплывающем окне.
Сканирование линии теперь будет откалиброваться для амплитуды с интенсивностью флуоресценции, выраженной как флуоресценция, разделенная нулевой флуоресценцией. STM будет отображать количество кадров в стеке TIFF на оси x и количество пикселей, представляющих длину ячейки на оси y. Для количественной оценки временных и пространственных данных из сигналов кальция нажмите Изображение и Свойства и введите соответствующие значения, чтобы полностью откалибровать STM для пространства и времени во всплывающем окне.
Чтобы проанализировать отдельные события кальция нажмите Прямая линия и нажмите и перетащите на STM, чтобы нарисовать прямую горизонтальную линию через центр кальция событие параллельно x-оси. Затем нажмите Анализ и Участок профиля. Появится коробка, показывающая профиль сюжета события кальция.
Для анализа данных сигнализации кальция ICC-MY на основе частиц откройте файл фильма в Volumetry и нажмите правой кнопкой мыши, чтобы выбрать STK Filter, Differentiate. Нажмите правой кнопкой мыши еще раз, чтобы ввести значение, чтобы дифференцировать. Нажмите Введите и левым щелчком мыши, чтобы инициировать дифференциацию.
Чтобы создать частицы, используйте среднюю кнопку мыши, чтобы прокрутить фильм, чтобы выбрать от 20 до 40 раздел кадра, который включает в себя период тихие, а затем появление переходного кластера кальция и от 20 до 40 кадров, которые следуют сразу после кластера. Когда все кадры были выбраны правой кнопкой мыши в окне фильма, чтобы получить доступ к информации частиц STK OPS Ramp DS и нажмите, чтобы запустить процедуру анализа частиц, которая постепенно увеличивает порог от максимальной до минимальной интенсивности. Чтобы обеспечить успешный анализ частиц, убедитесь, что вы включаете столько до кальция переходных кластера не-активности, и столько пост-кальция переходных кластера не активности, как вы можете.
Это поможет повысить соотношение сигнала к шуму. Анализ будет отображаться графически в окне участка как участок шума и в окне следов, как три цветовых следа с зеленым следом, представляющим количество частиц, красный след, представляющий средний размер частицы, и синий след, представляющий абсолютный порог интенсивности. Для того чтобы гистограмма балансирует график шума частицы нажимает H на клавиатуре.
Затем нажмите на правый ключ кронштейна, чтобы цикл через цветовые схемы, пока фон белый со следами цвета на вершине. Нажмите F на клавиатуре один раз, чтобы воспитывать измерительный инструмент. Затем нажмите F во второй раз, чтобы отметить одну вертикальную линию в строке прокрутки окна следов на участке на перекрестке, где цветные участки начинают смещаться в правую сторону.
В окне следов используйте среднюю кнопку мыши для прокрутки от точки перегиба красного следа до отмеченной белой вертикальной линии. После записи отображается Y среднем, нажмите среднюю кнопку мыши снова внутри окна следов, чтобы отбирать синий след. В окне фильма нажмите C, чтобы принести цветовое колесо, и D, чтобы настроить порог.
Действительные частицы теперь будут показаны красным цветом, а те, которые насыщаются, будут белыми. Используйте левую кнопку мыши, чтобы прокрутить, пока белые области не будут удалены и использовать среднюю кнопку мыши, чтобы настроить желтое числовое значение в колесе цвета к среднему значению Y, чтобы назначить все красным цветом в качестве активной переходной частицы кальция в определяемой пороговой точке. Чтобы сохранить данные в качестве файла частиц на основе координат, нажмите правой кнопкой мыши, чтобы получить доступ к STK 3D, сохраните частицу ноль и левое нажатие, чтобы сохранить файл.
Для создания тепловых карт активности частиц откройте сохраненный файл частиц и нажмите правой кнопкой мыши в окне фильма, чтобы получить доступ к частицам STKops, флагу StatMap и ввести задания флага для анализа. Нажмите, чтобы применить анализ и тепловую карту, показывающую общие частицы по всей длине записи с различными цветами, представляющими процентное явление на протяжении всей записи. Нажмите правой кнопкой мыши, чтобы сохранить тепловую карту в качестве файла TIFF.
Затем нажмите правой кнопкой мыши в окне фильма, чтобы получить доступ к измерению частиц, статистике частиц STK равно, и введите назначение флага для анализа. В окне трассировки будет создан ряд следов. Анализ STM обеспечивает возможность мониторинга и записи пространственных характеристик сигнализации кальция, таких как пространственное распространение и скорость распространения.
Эта информация может быть собрана, чтобы обеспечить довольно полное представление кальция сигнализации поведения в клетках в их родной среде. С помощью анализа частиц количественная информация о сигнализации кальция может быть рассчитана путем измерения площади частицы и количества частиц, которые вместе могут быть использованы для определения пространственных диапазонов активации сигнала кальция в пределах определенного поля зрения. Анализ частиц также позволяет провести углубленную количественную оценку субклеточной сигнализации кальция путем изучения местоположения и вероятности стрельбы по местам обжига кальция.
Распределяя частицы на различные флаги в зависимости от их временных характеристик, инициируя частицы могут быть точно отображены. И огромное количество твердых данных, полученных о количестве сайтов посвящения, размер сайта в пикселях и микрометрах, вероятность каждого места инициации стрельбы один или несколько раз во время каждого переходного кластера кальция, и процент огневых площадок, которые стреляют во время каждого переходного цикла кластера кальция могут быть получены. Последовательность является ключом к успеху в этом протоколе.
Все наборы данных и все фильмы должны рассматриваться точно так же, чтобы обеспечить надежные, повторяемые результаты. Это особенно верно при работе с файлами частиц. Наши протоколы позволяют получить глубокую характеристику сигнализации кальция на месте, а ряд статистических методов при надлежащем использовании может оценить различия между диапазоном пространственных и временных параметров.
Эти методы анализа в нашем протоколе позволили исследователям задать и ответить на ранее нерешенные вопросы, связанные с кишечным темпоотделом и иннервации кишечника, а также нейронного контроля нижних мочевыводящих путей.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Это исследование направлено на улучшение анализа данных кальциевой визуализации в экспериментах с тканями, конкретно с использованием генетически кодируемых индикаторов Ca2+ (GECIs). Оно предоставляет подробные протоколы, которые облегчают количественную оценку кальциевых сигналов с помощью передовых аналитических методов.
Ключевые компоненты исследования
Область исследования
- Кальциевая визуализация
- Количественная оценка сигналов
- Анализ тканей
Фон
- Улучшение получения данных из экспериментов по кальциевой визуализации
- Важность точных методов анализа для захвата кальциевой сигнализации
- Использование генетически-кодируемых индикаторов для in situ визуализации
Используемые методы
- Пространственно-временное картирование
- Анализ на основе частиц
- Методы микроскопии (конфокальный микроскоп)
Основные результаты
- Протоколы дают пространственные, временные и интенсивные данные, важные для понимания кальциевой сигнализации
- Повышенная точность измерения кальциевых событий и их свойств
- Создан рабочий фреймворк для анализа кластеров кальциевых транзиентов в образцах тканей
Выводы
- Исследование демонстрирует передовые методы для количественной оценки кальциевых сигналов в тканях
- Подчеркивает важность усовершенствованных аналитических подходов для лучшего понимания биологических аспектов кальциевой сигнализации
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of intracellular Ca2+ signaling in native tissue environments is critical for de-risking target validation in gastrointestinal and neuromuscular drug discovery. Spatio-temporal mapping and particle-based analysis enable extraction of spatial, temporal, and intensity parameters from high-resolution Ca2+ imaging data, reducing reliance on simplistic ROI measurements that overlook signaling complexity. This approach supports mechanistic insight into pacemaker activity and neuronal control pathways, informing predictive confidence in early discovery stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying Ca2+ signaling patterns such as frequency, duration, propagation velocity, and amplitude in intact tissues.
- Operational Value: Supports biological de-risking through detailed characterization of interstitial cells of Cajal (ICC) activity, a key regulator of gastrointestinal motility.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by linking Ca2+ signaling dynamics to intestinal pacemaking and neuronal control of the lower urinary tract.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating quantitative outputs from Ca2+ transient clusters in situ.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through calibrated spatiotemporal maps (STMs) and particle-based analysis with defined thresholding and flag assignment protocols.
- Scalability: Enables screening readiness via coordinate-based particle files and heat maps that allow high-volume data processing and cross-experiment comparison.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase Ca2+ signaling analysis in intestinal ICC to preclinical validation of motility disorders and urinary tract dysfunction.
- Mechanistic De-risking: Allows in-depth quantification of subcellular Ca2+ signaling through examination of initiation site location, firing probability, and cluster dynamics.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing hard data on the number of initiation sites, site size in pixels/micrometers, and percentage of firing sites active per transient cluster cycle.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery through Lead Identification to Preclinical work by providing quantitative Ca2+ signaling data that informs target validation and assay readiness.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by capturing spatial spread and propagation velocity of Ca2+ signals via STM analysis.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible quantification of particle area and count, enabling spatial range determination of Ca2+ signal activation in a defined field of view.
- Analytics: Generates statistical outputs on temporal characteristics of particles, allowing allocation into flags to map initiating particles and assess firing probabilities.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling analysis of Ca2+ signaling patterns linked to intestinal pacemaking and neuronal control pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for analyzing Ca2+ signaling across model systems through standardized protocols for STM calibration, particle analysis, and heat map generation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduction of mechanistic ambiguity in Ca2+ signaling dynamics.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability achieved via calibrated STMs, particle-based analysis with threshold adjustment, and coordinate-based data output.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by enabling early detection of inconsistent or non-reproducible signaling patterns.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions supported by quantitative data on initiation site density, size, and firing reliability.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in confocal microscopy, ImageJ, and Volumetry for STM generation and particle analysis.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include spinning disk confocal microscope, TIFF image stack handling, and software for line scan reslice, histogram balancing, and threshold adjustment.
- Cross-team standardization requirements involve consistent treatment of all data sets and movies to ensure reliable, repeatable results, particularly for particle file generation and flag-based analysis.
- Adaptation considerations across model systems include adjusting line scan orientation, frame selection for quiescent and active periods, and threshold calibration based on fluorescence intensity profiles.
- Practical limitations include the need for careful selection of 20–40 frame sections encompassing quiescent periods, Ca2+ transient clusters, and post-cluster activity to ensure successful particle analysis and optimal signal-to-noise ratio.
