Продольные морфологических и физиологических мониторинг сфероидов трехмерной опухоли с помощью оптическая когерентная томография

Оптическая когерентная томография (Окт), трехмерные технологии визуализации, был использован для мониторинга и характеризуют Кинетика роста многоклеточных опухоли сфероидов. Точные объемного количественной сфероидов опухоли с помощью voxel, считая подход и обнаружения метки бесплатно мертвых тканей в сфероидов, основанные на встроенных оптического затухания контраст, были продемонстрированы.

Трехмерные сфероиды опухоли могут имитировать специфические для тканей свойства опухолей in vivo, предоставляя более клинически значимые данные для обнаружения противоопухолевого препарата, чем простая культура 2D-клеток. Наша методика визуализации, оптическая когерентная томография, может легко визуализировать 3D-структуру одного опухолевых нервов, размером с несколько сотен микрон, и обеспечить более точную характеристику его морфологии и работы infest, часто в течение нескольких секунд. Используя 3D сферическую модель, мы потенциально можем сократить сроки обнаружения препарата, снизить стоимость и более эффективно доставить пациентам новые лекарства.

Формирование сферической формы опухолевого кластера является одним из важнейших этапов нашего эксперимента. Важно выбрать правую ультра-низкую пластину крепления с круглым дном и правильную скорость центрифугации после посева клеток. Начните этот эксперимент с выращивания клеток интересного в культуре колбы, как описано в рукописи.

Поддерживайте клетки в инкубаторе в стандартных условиях и следите за их состоянием здоровья каждый день. Обновите средства массовой информации по мере необходимости. Для выполнения 3D-клеточной культуры в многофункциональных пластин, сначала удалить среду из колбы культуры клеток, и мыть клетки с стерилизованной, 33 градусов по Цельсию предварительно нагревается PBS.

Затем добавьте один миллилитр трипсина-ЭДТА, чтобы повторно использовать клетки и инкубировать в течение трех минут при 37 градусах цельсия. Добавьте три миллилитров среды культуры, чтобы разбавить трипсин. Перенесите эту подвеску клетки в 15-миллилитровую центрифугу и центрифугу при температуре 500 г и комнатной температуре в течение пяти минут.

Затем удалите супернатант и повторно наполните клеточные гранулы четырьмя миллилитров предварительно разогретой среды культуры. Чтобы определить концентрацию клеток, гипат одну каплю образца на гемоцитометр, и подсчитать клетки. Разбавить до желаемой концентрации посева.

Семя 200 микролитров клеточной подвески в каждой колодец ультра-низкой крепления, круглое дно многоясовой пластины, в концентрации 3000 клеток на миллилитр, для достижения около 600 клеток на колодец. Сразу после посева центрифуга всей пластины на самой низкой доступной скорости, при комнатной температуре, в течение семи минут. Поместите тарелку в инкубатор при 37 градусах по Цельсию и 5%Co2, убедившись, что обновляется среды каждые три дня.

Во-первых, построить эталонную руку и образец руки системы OCT, следуя схемам в этой рукописи. Затем постройте спектрометр, включающий километр, сортировку, объектив F-Theta и камеру сканирования линии. Используйте адаптер пластины, чтобы держать пластину с несколько хорошо в фиксированном положении.

Перед визуализацией исправляйте наклон и вращение пластины с помощью 2D-стадии наклона и этапа вращения, установленного на переходной стадии, чтобы свести к минимуму изменение фокусной плоскости из разных скважин. Затем отрегулируйте вращение, чтобы обеспечить параллельные края пластины направлении движения сцены, чтобы скважины оставались в тех же горизонтальных положениях на изображениях OCT. Затем отрегулируйте этап наклона, чтобы убедиться, что пластина параллельна оптическому столу, так что скважины остаются в тех же вертикальных местах для изображения.

В день визуализации сфероидов опухоли удалите многоясную пластину из инкубатора. Перенесите его под систему визуализации OCT и поместите на адаптер пластины. Чтобы настроить высоту пластины, переместите ее по направлению к этапу перевода.

В пользовательском программном обеспечении для визуализации установите желаемый диапазон сканирования OCT, чтобы охватить весь сфероид опухоли, в зависимости от стадии его развития, и нажмите сохранить параметры, чтобы сохранить настройки. Затем покажите оптимизированные предварительные просмотры сфероидов опухолей на X и Y' OCT. Приобрети 3D OCT изображения опухолевых сфероидов один за другим для всех скважин пластины, содержащей сфероиды.

Чтобы просмотреть изображение предварительного просмотра, нажмите кнопку предварительного просмотра. А чтобы получить изображение OCT, нажмите кнопку приобретения. Запись общего этапа процесса перемещения данных OCT.

Для обеспечения оптимального качества изображения для всех сфероидов опухоли, адаптер пластины должны быть настроены точно и средний объем должен быть одинаковым. Используйте пользовательский код обработки C для обработки 3D наборов данных OCT опухолевых сфероидов для генерации структурных изображений OCT. Используйте 2D-изображения OCT в трех поперечных, XY, X и Y' плоскостях через центроид сфероида для создания коллажа сфероидных изображений.

Чтобы получить 3D визуализацию сфероида с помощью желаемого программного обеспечения, сначала загрузите данные SD OCT в программное обеспечение. Нажмите на панель surpass, затем добавьте новый объем и выберите режим смешивания для использования для 3D-рендеринга. Чтобы настроить угол обзора, используйте указатель мыши, чтобы перетащить изображение и продолжить количественную оценку, описанную в рукописи.

Коллаж из невозмутимых OCT-изображений сфероидов клеточной линии HCT116 был создан на основе обработанных данных, результаты сравнимы с изображениями из других 2D высокой пропускной способности систем визуализации. Кроме того, коллаж из 2D поперечных фероидных изображений из 96 скважин был создан для мониторинга высот сфероидов и визуализации неоднородности сфероидов в вертикальном направлении. Коллаж из 3D-рендероидных изображений может быть создан с любого заранее определенного угла, чтобы визуализировать общую 3D-форму и оценить округлость сфероида.

После общей OCT после обработки, 3D OCT структурные изображения сфероида опухоли были получены. На основе данных OCT для визуализации структуры сфероида опухоли в любом направлении были созданы 3D поверхностный столб и ортогональные ломтики X, Y и XY. Продольный мониторинг одного сфероида опухоли был проведен для характеристики его диаметра, высоты и объема на основе воксела, генерируя кривые роста в размерах и объеме в течение 21-дневного развития.

Здесь сфероид был нарушен на 11-й день, и полностью рухнул на 21-й день. Продольное слежение показало увеличение областей мертвых клеток в сфероиде опухоли. 3D-изображения сфероида опухоли показали появление и рост областей мертвых клеток с седьмого дня до 14-го дня, о чем свидетельствует увеличение красных выделенных некротических областей.

По мере увеличения доли некротических областей, сфероид опухоли не мог поддерживать свою идеальную форму, и, следовательно, рухнул. С помощью этой платформы визуализации мы можем дополнительно исследовать другие сложные модели опухолевых сфер, такие как 3D-модель изображения, обширная модель существ и модели совместной культуры, чтобы лучше моделировать опухоли in vivo. Наша высокой пропускной способности OCT визуализации система может обеспечить измененный подход для скрининга наркотиков в открытии рака наркотиков.

Это то, что также характеризуется, 3D биофабрикатов образцов для различных биомедицинских приложений.